祝子銅，徐佳文，雷美康，彭 芳，章應(yīng)俊

（衢州出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 衢州 324002）

HPLC-MS-MS同位素內(nèi)標(biāo)法測(cè)定火腿中14 種喹諾酮類殘留量

祝子銅，徐佳文，雷美康，彭 芳，章應(yīng)俊

（衢州出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 衢州 324002）

建立同時(shí)測(cè)定火腿中14 種喹諾酮類化合物高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。樣品采用乙腈提取，乙腈飽和正己烷脫脂，經(jīng)MAX固相萃取小柱凈化，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子模式測(cè)定，使用同位素內(nèi)標(biāo)定量。14 種喹諾酮類檢出限為0.6 μg/kg。方法平均回收率在70.0%～115.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.2%～15.6%之間。該方法前處理簡(jiǎn)便快速、選擇性好、靈敏度高，可作為日常的檢測(cè)方法在實(shí)驗(yàn)室中使用。

火腿；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；同位素內(nèi)標(biāo)法；喹諾酮類

喹諾酮類藥物是近年來研究較多的一類抗菌藥，被廣泛用于人和動(dòng)物疾病的治療，但該類藥物在動(dòng)物體內(nèi)的殘留可通過食物鏈對(duì)人體健康構(gòu)成危害[1]。目前，我國(guó)農(nóng)業(yè)部以及世界衛(wèi)生組織、美國(guó)、歐盟、日本等國(guó)家和組織都將該類藥物列入限制使用的獸藥名單中，并制定出相關(guān)的最高殘留限量[2]。出口至美國(guó)、加拿大等國(guó)家的動(dòng)物源性食品喹諾酮類檢測(cè)項(xiàng)目達(dá)15 項(xiàng)之多，出口至日本的檢測(cè)項(xiàng)目也有10 項(xiàng)。因此，為確保出口產(chǎn)品的安全，打破國(guó)外的技術(shù)壁壘，有必要建立一個(gè)簡(jiǎn)便快速的動(dòng)物源性食品中喹諾酮類藥物的檢測(cè)方法。

目前對(duì)于喹諾酮類藥物殘留的報(bào)道很多，主要方法有高效液相色譜法[3-7]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS-MS）法[8-15]、毛細(xì)管電泳法[16-17]、氣相色譜-質(zhì)譜法[18]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，針對(duì)國(guó)標(biāo)方法中采用正己烷凈化后[19]，還存在著很強(qiáng)的基質(zhì)干擾，對(duì)凈化條件進(jìn)行了優(yōu)化，采用正己烷脫脂后，調(diào)節(jié)pH值至11，使用MAX固相萃取柱（solid phase extraction，SPE）凈化，三重四極桿-質(zhì)譜同位素內(nèi)標(biāo)法分析火腿中14 種喹諾酮類藥物。該方法前處理簡(jiǎn)便快速、選擇性好、靈敏度高、基質(zhì)干擾小，完全能夠滿足世界各國(guó)對(duì)火腿中喹諾酮類藥物殘留的限量要求，本方法可在實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)中使用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MAX SPE（150 mg/6 mL） 上海安譜公司；甲醇、乙腈、正己烷（均為色譜純） 德國(guó)默克公司；甲酸、冰乙酸（均為色譜純） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；氫氧化鈉（分析純） 上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、單諾沙星、奧比沙星、沙拉沙星、馬波沙星、依諾沙星、洛美沙星、雙氟沙星、惡喹酸、萘啶酸、氟甲喹 德國(guó)Dr Ehrenstorfer公司；依諾沙星-D8、氧氟沙星-D3、諾氟沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8、恩諾沙星-D5、雙氟沙星-D4、沙拉沙星-D8 德國(guó)Witega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260-6460型液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀 美國(guó)安捷倫科技公司；12位固相萃取裝置 德國(guó)CNW公司；Biofuse primo R離心機(jī)、Barnstead Nanopure超純水儀 美國(guó)賽默飛公司；MS3漩渦振蕩器、T18BASIC ULTRA-TURRAX均質(zhì)器 德國(guó)IKA公司；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；N-EVAPTM111氮吹儀 美國(guó)Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別精密稱取適量的喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品和喹諾酮類氘代內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品，加入一定量的甲酸溶解標(biāo)準(zhǔn)品，再用甲醇稀釋并定容，其中惡喹酸先用氨水溶解，再用甲醇稀釋并定容，配制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。該溶液在4 ℃的冰箱中保存。

中間標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋成1.0 μg/mL混合溶液。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：吸取不同體積的中間標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用體積分?jǐn)?shù)0.15%甲酸溶液配成2、5、10、20、50 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中內(nèi)標(biāo)為20 ng/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取火腿樣品2 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液，加入20 mL乙腈，均質(zhì)2 min，渦旋提取1 min，以6 000 r/min離心5 min，取出上清液于150 mL分液漏斗中，再加入20 mL乙腈，重復(fù)上述操作，合并提取液于分液漏斗中，加入25 mL乙腈飽和正己烷，振搖2 min，靜置待兩相分層，取出乙腈層于雞心瓶中，在45 ℃條件下旋蒸至近干，加入5 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，再加入10 mL超純水溶解殘?jiān)D(zhuǎn)移至50 mL離心管中，以6 000 r/min離心5 min，棄去正己烷層，水相用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至11，待凈化。

MAX SPE柱用5 mL甲醇、5 mL水活化平衡，將樣品溶液倒入SPE小柱中，依次用5 mL體積分?jǐn)?shù)5%氨水、5 mL甲醇淋洗，用9 mL 體積分?jǐn)?shù)5%甲酸-甲醇進(jìn)行洗脫，接收全部洗脫液，50 ℃條件下用氮?dú)獯蹈?，加? mL體積分?jǐn)?shù)10%甲醇溶液（含體積分?jǐn)?shù)0.15%甲酸），超聲1 min，渦旋混合1 min，過0.22 μm濾膜，待分析。

1.3.3 HPLC條件

色譜柱：Zorbax XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A相為體積分?jǐn)?shù)0.15%甲酸溶液；B相為甲醇；柱溫40 ℃；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；HPLC流速及梯度洗脫見表1。

表1 液相色譜流速及梯度洗脫程序Table1 HPLC flow rate and gradient elution program

1.3.4 MS參數(shù)

表2 14 種喹諾酮類MS測(cè)定條件Table2 Optimized spectrometric parameters for 14 quinolone residues

電噴霧離子源，正離子模式；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速5 L/min；噴霧氣壓力45 psi；鞘氣溫度400 ℃；鞘氣流速：12 L/min；毛細(xì)管電壓4 000 V；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描采集參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件優(yōu)化

喹諾酮類分為哌嗪喹諾酮和酸性喹諾酮。喹諾酮既有羧基又有哌嗪環(huán)，因此在水溶液中具有酸性和堿性2 種性質(zhì)。喹諾酮類藥物的這種特殊特性決定其可溶于多種溶液而能從生物樣品中提取出來。喹諾酮類藥物常用的提取溶劑有酸性溶液、堿性溶液、純有機(jī)溶劑。本研究比較了乙腈-甲酸、乙腈-乙酸、乙腈、甲醇-乙酸、甲醇-甲酸、甲醇等提取溶液進(jìn)行提取的效果，發(fā)現(xiàn)乙腈、乙腈-甲酸體系作為提取溶液對(duì)大部分喹諾酮類的提取效果較好。但是乙腈-甲酸作為提取試劑，提取后溶液比較渾濁，干擾物較多，在HPLC-MS-MS分析中基質(zhì)抑制效應(yīng)很強(qiáng)，其次，隨著甲酸的加入，萘啶酸、氟甲喹、惡喹酸這幾個(gè)化合物提取效率降低，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的乙酸乙酯、丙酮和酸化甲醇主要用于提取酸性喹諾酮，乙腈、酸化乙腈適合提取哌嗪類喹諾酮一致。因此，本實(shí)驗(yàn)采用純乙腈作為提取溶液進(jìn)行提取。

2.2 凈化條件優(yōu)化

2.2.1 SPE柱的選擇

圖1 MAX固相萃取柱凈化后火腿樣品中喹諾酮類的選擇離子色譜圖Fig.1 SRM chromatograms of 14 QNS purified with MAX SPE column

圖2 正己烷凈化后火腿樣品中喹諾酮類的選擇離子色譜圖Fig.2 SRM chromatograms of 14 QNS purified with hexane

由于火腿樣品基質(zhì)復(fù)雜，特別是火腿中含有大量的脂肪成分，在HPLC-MS-MS分析中存在嚴(yán)重的基質(zhì)抑制作用。要同時(shí)分析多種喹諾酮類藥物殘留，僅僅通過采用正己烷去脂一步凈化不能有效地去除干擾物質(zhì)。因此，本研究采用正己烷先去脂，再過SPE小柱對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步凈化。目前已經(jīng)開發(fā)了各種各樣通用的SPE方法，如果樣品前處理所采用的原理和液相色譜分析的原理是正交不相關(guān)的，則通?？梢缘玫阶詈玫膬艋Y(jié)果。正交的方法有時(shí)又被稱為二維方法，它采用2 個(gè)完全不同的分離模式或保留機(jī)理來極大地提高分離能力[20]。舉例來說，如果樣品前處理后進(jìn)行反相HPLC分析，則選擇性最好的SPE方法是離子交換作用。喹諾酮類具有酸性和堿性2 種性質(zhì)，在水溶液中以離子態(tài)的形式存在。因此，本研究采用MAX SPE小柱進(jìn)行凈化。由圖1和圖2比較后可以得出，經(jīng)過MAX SPE小柱凈化后，各化合物受基質(zhì)抑制影響減弱、色譜峰形明顯改善、靈敏度提高。

2.2.2 上樣液pH值的選擇

用氫氧化鈉溶液將超純水分別調(diào)至pH值為9.0、10.0、11.0、12.0，然后添加相同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)?？傮w而言，14 種喹諾酮類藥物在4 個(gè)pH值條件下都有較高的回收率，而pH 11.0時(shí)大部分藥物回收率最高。pH 9.0～10.0時(shí)，環(huán)丙沙星、氧氟沙星、奧比沙星、雙氟沙星回收率較低。因此，本研究選用pH 11.0為上樣液的最佳pH值。

2.2.3 洗脫液的選擇

配制甲酸-甲醇（5∶95，V/V）溶液，分別取6、7、8、9、10 mL進(jìn)行洗脫，并計(jì)算回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示6～8 mL甲酸-甲醇溶液不能完全將喹諾酮類藥物洗脫下來。當(dāng)洗脫液體積達(dá)到9 mL時(shí)，喹諾酮類能夠被完全洗脫。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇使用9 mL甲酸-甲醇溶液作為洗脫液。

2.3 色譜條件優(yōu)化

色譜柱是色譜分析的核心，同一樣品在不同填料的色譜柱上分離效果不同，通過Agilent Zorbax XDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Agilent Zorbax SB-C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Agilent Eclipse XDB-C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）3 種色譜柱考察了15 種化合物的分離度和峰形，Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，喹諾酮類化合物峰形較差，Agilent Zorbax XDB-C18、Agilent Zorbax SB-C18色譜柱都能夠達(dá)到基線分離大部分喹諾酮類物質(zhì)，考慮到火腿樣品基質(zhì)復(fù)雜，且實(shí)驗(yàn)室樣品量較大，而5 μm色譜柱抗污染能力較強(qiáng)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇Agilent Zorbax XDB-C18色譜柱作為日常分析柱。

2.4 質(zhì)譜參數(shù)建立

本研究采用HPLC進(jìn)樣方式在正離子模式下對(duì)待測(cè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行一級(jí)全掃描，確定準(zhǔn)分子離子峰[M＋H]＋，再分別以待測(cè)化合物的準(zhǔn)分子離子為母離子進(jìn)行碎裂，進(jìn)行二級(jí)子離子掃描，選擇2 個(gè)特征子離子，分別選擇信噪比高、峰形好、干擾小的離子對(duì)作為定量離子對(duì)。對(duì)于喹諾酮類，二級(jí)質(zhì)譜圖都有明顯的[M＋H—H2O]＋和[M＋H—CO2]＋峰，同時(shí)由于喹啉環(huán)的6、7位被氟原子與哌嗪基取代，因而與丟失HF和因派嗪基團(tuán)上C—N鍵與C—C鍵斷裂而造成H轉(zhuǎn)移形成新基團(tuán)所產(chǎn)生的峰也十分突出。

2.5 內(nèi)標(biāo)物選擇

應(yīng)用HPLC-MS-MS技術(shù)分析樣品中痕量獸藥殘留時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)是時(shí)常遇到的現(xiàn)象，基質(zhì)效應(yīng)可導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果重復(fù)性差，定量結(jié)果難以保證[21]。同位素內(nèi)標(biāo)法是目前HPLC-MS-MS分析中經(jīng)常使用的一種定量技術(shù)，由于同位素內(nèi)標(biāo)物結(jié)構(gòu)與目標(biāo)分析物一致，受基質(zhì)影響程度相同，在質(zhì)譜中的碎裂行為相似。因此，同位素內(nèi)標(biāo)法可有效地降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高定量的準(zhǔn)確性。本方法選用目前能夠購(gòu)買到的依諾沙星-D8、氧氟沙星-D3、諾氟沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8、恩諾沙星-D5、雙氟沙星-D4、沙拉沙星-D8作為相對(duì)應(yīng)化合物喹諾酮類的內(nèi)標(biāo)物，而奧比沙星、司帕沙星、馬波沙星、單諾沙星、洛美沙星、惡喹酸、氟甲喹和萘啶酸沒有相對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)。本研究分別使用上述7 種同位素內(nèi)標(biāo)物作為奧比沙星的內(nèi)標(biāo)并作校準(zhǔn)曲線，用上述校準(zhǔn)曲線對(duì)實(shí)際加標(biāo)樣品進(jìn)行計(jì)算，選取回收率結(jié)果與實(shí)際加標(biāo)最接近的曲線作為校準(zhǔn)曲線，該校準(zhǔn)曲線的內(nèi)標(biāo)物為雙氟沙星-D4。司帕沙星、馬波沙星、單諾沙星、洛美沙星、惡喹酸、氟甲喹和萘啶酸的內(nèi)標(biāo)依據(jù)上述方法選取。14 種喹諾酮類對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物見表2。

2.6 方法的線性關(guān)系、檢出限和定量限

在本實(shí)驗(yàn)所確定的條件下，以待測(cè)物質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品與同位素內(nèi)標(biāo)物峰面積比值y為縱坐標(biāo)，分別繪制14 種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線，由表3可知，14 種喹諾酮類在2～20 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。該方法的檢出限和定量限由空白樣品添加回收實(shí)驗(yàn)獲得，以3 倍信噪比為檢出限、10 倍信噪比為定量限，14 種喹諾酮類獸藥的檢出限和定量限分別為0.6 μg/kg和2.0 μg/kg。

表3 14 種喹諾酮類的線性方程及線性范圍Table3 Linear ranges and regression equations forof 14 quinolone residues

2.7 精密度和回收率

為測(cè)定本方法的精密度和回收率，實(shí)驗(yàn)選用空白火腿為樣品基質(zhì)，添加不同量的喹諾酮類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)化合物做2.0、5.0、10.0 μg/kg 3 個(gè)水平的添加，每個(gè)添加水平均做6 平行樣，其結(jié)果見表4。由表4可以看出，14 種喹諾酮類方法平均回收率在70.0%～115.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.2%～15.6%之間。方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合殘留分析的要求。

表4 回收率與精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table4 Mean recovery rates and precision for 6 replicate determinations (n=6)

續(xù)表4

3 結(jié) 論

本研究建立火腿中14 種喹諾酮類殘留檢測(cè)的HPLCMS-MS分析方法。通過對(duì)HPLC條件和MS條件各項(xiàng)參數(shù)的優(yōu)化，以及采用MAX SPE柱對(duì)樣品提取液凈化和同位素內(nèi)標(biāo)法補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)，使得方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均能滿足獸藥殘留分析方面的要求。本方法可用于實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)，用此方法對(duì)100多份樣品進(jìn)行了檢測(cè)，均取得了滿意的結(jié)果。

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Determination of 14 Quinolone Residues in Ham by HPLC-MS-MS with Isotopic Internal Standard

ZHU Zi-tong, XU Jia-wen, LEI Mei-kang, PENG Fang, ZHANG Ying-jun
(Quzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Quzhou 324002, China)

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS) was developed for simultaneous determination of 14 quinolone residues (QNS) in ham. Ham sample was extracted with acetonitrile, defatted with hexane saturated with acetonitrile and cleaned up by MAX solid phase extraction. The mass spectrometer was operated in the positive ion mode using select reaction monitoring for qualitative and quantitative analysis. Isotope internal standard was used for quantitative analysis. The limit of detection of the method was 0.6 μg/kg. Mean recovery rates for 14 QNS in a negative ham sample spiked at three levels were between 70% and 115%, with RSD ranging from 1.2% to 15.6%. This method proved to be of simplicity, high sensitivity and good selectivity. It has been used for routine test in our laboratory.

ham; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS); isotopic internal standard method; quinolone (QNS)

TS207.3

A

1002-6630（2014）20-0258-07

10.7506/spkx1002-6630-201420051

2014-01-08

祝子銅（1985—），男，工程師，碩士，主要從事動(dòng)物源產(chǎn)品中抗生素殘留檢測(cè)研究。E-mail：zztzzt1124@163.com