吳方評(píng)，蒲艷春，楊 勇，楊宏健

(懷化醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，湖南 懷化 418000)

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.的干燥近成熟的果實(shí)，主要分布于貴州、廣西、湖南等地，有散寒止痛，降逆止吐，助陽(yáng)止瀉之功效[1]，臨床常用于治療高血壓、疼痛、腹瀉、嘔吐等癥[2-5]。吳茱萸含有多種化學(xué)成分，目前從中提取的主要有揮發(fā)油、苦味素和生物堿等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為，吳茱萸堿、吳茱萸次堿是吳茱萸中的重要藥理活性成分，具有保護(hù)心臟[6-8]、抑制血栓形成[9]、抗癌[10]和抗菌[11]等作用。鑒于吳茱萸堿、吳茱萸次堿的生物活性，許多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了大量提取方法的探索，但所用方法普遍存在工藝復(fù)雜、溶劑消耗量大、提取成本高等缺點(diǎn)。由于微波提取具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢(shì)，本試驗(yàn)中優(yōu)選了吳茱萸生物總堿的最佳提取條件，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

MENS 型中藥微波萃取儀;Agilent 1200 型單元泵高效液相色譜儀;可變波長(zhǎng)檢測(cè)器;FA2004 型電子天平(上海方瑞儀器有限公司);索式提取器;干燥器等。吳茱萸堿對(duì)照品(批號(hào)為110802 -200606)、吳茱萸次堿對(duì)照品(批號(hào)為110801 -201006)，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;乙腈、甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)均為色譜純;石油醚、無(wú)水乙醇(天津市富宇精化工有限公司)均為分析純;二次蒸餾水。共收集不同產(chǎn)地的吳茱萸果實(shí)5 批，經(jīng)專家鑒定，均為蕓香科植物吳茱萸的成熟果實(shí)。不同產(chǎn)地的吳茱萸樣品信息見(jiàn)表1。

表1 不同產(chǎn)地樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Eclipse XDB - C18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:水-甲醇-乙腈(42 ∶20 ∶38);進(jìn)樣量:20 μL;流速:0.5 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):240 nm。

2.1.2 樣品處理及溶液制備

取吳茱萸原料，于80 ℃烘箱中干燥2.5 h，粉碎，過(guò)篩，索氏提取脫脂2 h，晾干，精密稱取脫脂吳茱萸0.1 g，置250 mL 聚四氟乙烯消化罐中，加入提取溶劑，潤(rùn)濕40 min，于中藥微波萃取儀中提取，放置室溫，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用提取溶劑定容至刻度，進(jìn)樣前用0.45 μm 針頭過(guò)濾器過(guò)濾，作為供試品溶液。分別精密稱取對(duì)照品吳茱萸堿1.9 mg 和吳茱萸次堿1.6 mg，置10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制備成質(zhì)量濃度分別為0.19 g/L和0.16 g/L 的吳茱萸堿對(duì)照品溶液和吳茱萸次堿對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn):按擬訂色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果吳茱萸堿和吳茱萸次堿分離良好，無(wú)雜質(zhì)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:分別精密抽取吳茱萸堿對(duì)照品溶液(0.19 g/L)和吳茱萸次堿對(duì)照品溶液(0.16 g/L)1，2，4，8，16 μL，按擬訂色譜條件依法進(jìn)樣，記錄色譜峰。結(jié)果吳茱萸堿質(zhì)量濃度在4.00 ～128.00 μg/mL 之間、吳茱萸次堿質(zhì)量濃度在4.75 ～152.00 μg/mL與峰面積呈良好線性關(guān)系，吳茱萸堿與吳茱萸次堿的回歸方程分別為Y=196 658 X(r=0.999 6);Y=278 868 X，(r=0.999 0)。

精密度試驗(yàn):取上述2 種對(duì)照品溶液各1 mL，置10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，分別依法同體積重復(fù)進(jìn)樣5 次。結(jié)果吳茱萸堿的RSD 為0.72%，吳茱萸次堿的RSD 為0.85%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密稱取湖南產(chǎn)樣品0.1 g，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8 h 時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定吳茱萸堿和吳茱萸次堿的峰面積。結(jié)果吳茱萸堿的RSD 為1.51%，吳茱萸次堿的RSD 為0.93%，表明供試品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):分別稱取不同產(chǎn)地已知吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量的吳茱萸樣品各5 份，依法處理并進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 提取溶劑選擇

試驗(yàn)研究了乙酸乙酯、丙酮、不同濃度的乙醇和甲醇等溶劑對(duì)吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率的影響，在以微波提取功率400 W、提取時(shí)間8 min、溶劑倍數(shù)1 ∶200 的條件下。結(jié)果以90%乙醇為提取溶劑提取效果最佳。

2.3 提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將吳茱萸粉末用索氏提取器提取2 h，取出，干燥，再精密稱取0.1 g 吳茱萸粉末，置250 mL 聚四氟乙烯樣品瓶中，用90%乙醇密封浸潤(rùn)40 min，在微波萃取儀中進(jìn)行提取，提取液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用提取液定容至刻度，用0.45 μm 針頭過(guò)濾器過(guò)濾。

表2 吳茱萸堿和吳茱萸次堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，在用90%乙醇為溶劑的前提下，考察提取功率(因素A)、提取時(shí)間(因素B)、料液比(因素C)、顆粒粒徑(因素D)等因素對(duì)提取率的影響。正交試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表3，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)提取吳茱萸堿和吳茱萸次堿，結(jié)果及極差分析見(jiàn)表4，方差分析見(jiàn)表5。

表3 正交試驗(yàn)的因素水平表

表4 提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

表5 正交試驗(yàn)方差分析表

極差分析數(shù)據(jù)表明，對(duì)于吳茱萸堿，提取功率為400 W，提取時(shí)間為6 min，溶劑倍數(shù)為1 ∶100 時(shí)，提取率較高，顆粒粒徑對(duì)提取率影響不大;對(duì)于吳茱萸次堿，提取功率為400 W，提取時(shí)間為6 min，溶劑倍數(shù)為1 ∶100 時(shí)提取率較高，顆粒粒徑對(duì)提取率影響不顯著。方差分析結(jié)果顯示，溶劑倍數(shù)、提取功率、提取時(shí)間和顆粒粒徑對(duì)吳茱萸堿和吳茱萸次堿影響不大。綜合極差和方差分析，同時(shí)考慮到經(jīng)濟(jì)因素，提取吳茱萸堿的最佳條件為A2B3C1D3，提取吳茱萸次堿的最佳條件為A2B3C1D2，考慮到粒度對(duì)吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率影響較小。綜合以上因素，選定提取吳茱萸堿和吳茱萸次堿的最佳條件為A2B3C1D2，即提取功率為400 W，提取時(shí)間為6 min，溶劑倍數(shù)為1 ∶100，顆粒粒徑為0.150 mm。

2.4 各產(chǎn)地吳茱萸總生物堿含量提取比較

分別取重慶、廣西、青島、北京同仁堂、湖南5 個(gè)產(chǎn)地的吳茱萸藥材，按2.3 項(xiàng)下方法操作進(jìn)行提取，條件為A2B3C1D2，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)表6?？梢?jiàn)，廣西產(chǎn)吳茱萸提取的吳茱萸生物總堿最多。

表6 吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

在溶劑選取中，分別選用乙酸乙酯、丙酮、5 個(gè)不同濃度的乙醇和甲醇作為微波提取溶劑。結(jié)果表明，90%乙醇提取率較高，故選取90%乙醇作為提取溶劑;提取時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)，微波提取功率適當(dāng)增大，對(duì)提取率有利，但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，提取功率過(guò)大，溫度升高過(guò)快，溶劑揮發(fā)較大，提取率反而降低;樣品粒度對(duì)提取率影響較小。綜合以上因素，試驗(yàn)選定提取吳茱萸堿和吳茱萸次堿的最佳條件為A2B3C1D2，即提取功率為400 W，提取時(shí)間為6 min，溶劑倍數(shù)為1 ∶100，顆粒粒徑為0.150 mm。試驗(yàn)結(jié)果表明，上述條件比傳統(tǒng)的提取方法有提取時(shí)間更短，生物堿的轉(zhuǎn)移率更高等優(yōu)點(diǎn)，可用于吳茱萸中吳茱萸生物總堿的提取。

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