王 強，李貴節(jié)，趙 欣，任彥榮

（重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶 400067）

羅非魚肉蛋白酶解液的制備及體內(nèi)外抗氧化活性研究

王 強，李貴節(jié)，趙 欣，任彥榮

（重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶 400067）

采用木瓜蛋白酶酶解羅非魚肉蛋白，通過測定不同劑量羅非魚肉蛋白酶解液的還原力，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）自由基、·OH和O2－·清除率及對D-半乳糖致衰老模型小鼠的抗氧化作用，評價羅非魚肉蛋白酶解液的體內(nèi)外抗氧化特性。結(jié)果表明：羅非魚肉蛋白酶解液具有較高的還原力，清除DPPH自由基、·OH和O2－·的半數(shù)有效質(zhì)量濃度分別為1.57、1.68 mg/mL和2.76 mg/mL；羅非魚肉蛋白酶解液能顯著提高小鼠血清和肝臟組織中超氧化物歧化酶活力、谷胱甘肽過氧化物酶活力和總抗氧化能力（P＜0.05），同時使血清和肝臟組織中的丙二醛含量顯著降低（P＜0.05）。羅非魚肉蛋白酶解液有較強的體內(nèi)外抗氧化活性。

羅非魚肉；酶解液；體外抗氧化活性；D-半乳糖衰老模型小鼠

在生物氧化代謝過程中，會不斷產(chǎn)生各種自由基，而自由基過多與體內(nèi)多種功能性障礙和疾病發(fā)生有關(guān)，是引起機體衰老根本原因，也是誘發(fā)腫瘤、癌癥等惡性疾病的重要原因[1]。研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化活性肽通過減少自由基，阻斷脂質(zhì)氧化的鏈式反應(yīng)，從而達到抗氧化、延緩衰老的作用[2-3]。其中動物源抗氧化肽如沙丁魚抗氧化肽[4]、雞胸抗氧化肽[5]、紫貽貝抗氧化肽[6]、鹿肉抗氧化肽[7]等，在體外有較強的抗氧化活性，有的在體內(nèi)也有抗氧化的效果。蛋白質(zhì)酶解液是生物活性肽的主要來源，這些生物活性肽具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖和降血壓等作用[1,8-9]。

羅非魚（Oreochromis niloticus）又稱非洲鯽魚，屬鱸形目、鱺魚科，具有生長快、肉質(zhì)好、產(chǎn)量高等特點。我國是世界上最大的羅非魚生產(chǎn)國，年產(chǎn)量約占世界年產(chǎn)總量的一半[10]。羅非魚肉蛋白酶解液中含有較豐富的多肽和氨基酸，盡管近年來已有羅非魚酶解液抗氧化特性的相關(guān)報道[11-12]，但僅限于研究體外，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）自由基、·OH等自由基的抗氧化性未見有關(guān)其在體內(nèi)抗氧化特性的報道。為此，本研究采用木瓜蛋白酶，制備羅非魚肉蛋白酶解液，研究羅非魚肉蛋白酶解液在體內(nèi)外的抗氧化特性，以期為羅非魚肉蛋白酶解液的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、動物、試劑與儀器

羅非魚購于附近農(nóng)貿(mào)市場，取羅非魚肉，絞碎，放置于聚乙烯袋內(nèi)于－18 ℃凍藏備用。

昆明種小鼠50只，雌雄各半，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，購自重慶第三軍醫(yī)大學。

木瓜蛋白酶、D P P H、D-半乳糖 美國Sigma-Aldrich公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidative capacity，T-AOC）試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；所用水為雙蒸水，所用其他溶液均自行配制。

DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海齊欣科學儀器有限公司；FA2004A型分析天平 上海精天科貿(mào)有限公司；UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；TGL-16G高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 羅非魚肉蛋白酶解液的制備

根據(jù)預(yù)實驗，將羅非魚肉50 g與蒸餾水100 mL混合勻漿，按質(zhì)量比1.5∶1 000加入木瓜蛋白酶，在52 ℃、pH 6.5條件下酶解6 h，置沸水中滅酶15 min，冷后于4 ℃、4 000 r/min離心20 min，取上清液進行抽濾，濾液即為實驗所用的酶解液。

1.2.2 體外抗氧化活性的測定

1.2.2.1 還原力的測定

參照文獻[13]的方法，在具塞比色管中加入0.2mol/L、pH 6.6的磷酸緩沖液2 mL、不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL）0.2 mL和質(zhì)量分數(shù)為1%的鐵氰化鉀溶液2 mL，50 ℃水浴反應(yīng)20 min后迅速冷卻，加入質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸溶液2 mL，3 000 r/min離心20 min，取上清液2 mL，加入2 mL蒸餾水和質(zhì)量分數(shù)為0.1%的三氯化鐵0.4 mL，混勻后室溫放置10 min，測定A700nm。

1.2.2.2 清除DPPH自由基的測定

參照文獻[14]進行，將DPPH溶液2 mL（10–4mol/L， 95%乙醇）與不同質(zhì)量濃度（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL）的樣品溶液2 mL混勻后于波長517 nm處測定吸光度（Ai），同時，將DPPH溶液2 mL與樣品空白2 mL混勻后測定吸光度（Ac），將不同濃度的樣品溶液2 mL與95%乙醇2 mL混勻后測定吸光度（Aj），按式（1）計算DPPH自由基清除率。

1.2.2.3 清除·OH的測定

參照文獻[15]方法并略有修改。取0.6 mL 5 mmol/L鄰二氮菲的乙醇溶液，加入0.4 mL的磷酸鹽緩沖液（0.15mol/L，pH 7.40）和0.6 mL 0.75 mmol/L的FeSO4溶液，加入待測酶解液2 mL混勻后，加入0.4 mL 0.1%的H2O2搖勻，37 ℃條件下水浴60 min，在536 nm波長處測其吸光度（Ai）；以去離子水代替酶解液和H2O2溶液重復上述操作，在536 nm波長處測其吸光度（Ac）；以去離子水代替酶解液來重復以上操作，在536 nm波長處測得吸光度（Aj）。按式（2）計算·OH清除率。

1.2.2.4 清除O2–·的測定

參照文獻[16]，取酶解液0.1 mL，加入0.1mol/L Tris-HCl（pH8.2）緩沖溶液2.8 mL混勻，在25 ℃水浴10 min后加入3 mmol/L的鄰苯三酚溶液（25 ℃水浴預(yù)熱）0.1 mL，混勻后迅速在320 nm波長處測定吸光度，每隔30 s讀取A320nm，5 min后結(jié)束；以去離子水0.1 mL和0.1 mol/L的Tris-HC1（pH 8.2）緩沖溶液2.8 mL調(diào)零；空白對照管以去離子水代替酶解液。作吸光度隨時間變化的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率v，按式（3）計算O2－·清除率。

1.2.3 體內(nèi)抗氧化活性的測定

1.2.3.1 實驗動物條件和分組

實驗小鼠飼養(yǎng)條件為：溫度18～22 ℃、相對濕度45%～55%，自然光照，自由采食和飲水。實驗前將50只小鼠在實驗環(huán)境下給予基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)7 d，按體質(zhì)量隨機分成5組（雌雄各半分籠飼養(yǎng)），分別是正常對照組、模型對照組、羅非魚肉蛋白酶解液低、中、高劑量組。除正常對照組外，其余4組腹腔注射500 mg/（kg·d）D-半乳糖，同時羅非魚肉蛋白酶解液低、中、高劑量組按125、250、500 mg/（kg·d）的劑量灌胃羅非魚肉蛋白酶解液，正常對照組注射等體積生理鹽水，灌胃等體積的蒸餾水，實驗持續(xù)42 d。

1.2.3.2 樣品的制備和抗氧化活性的測定

實驗小鼠末次灌胃后，禁食l2 h，斷頭取血致死，收集血液，4 000 r/min離心10 min，上清液備用。解剖小鼠，取出肝臟，稱取0.1 g肝臟，加入9倍體積的生理鹽水于勻漿器中制成組織勻漿液，4 000 r/min離心10 min，取上清液備用。所有處理均在4 ℃條件下完成。

樣品的SOD活力、GSH-Px活力、MDA含量和T-AOC采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進行測定；蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍法。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抗氧化活性分析

研究發(fā)現(xiàn)，物質(zhì)的還原能力與它潛在的抗氧化活性密切相關(guān)?？寡趸镔|(zhì)能夠提供電子把鐵氰化鉀中Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+在700 nm波長處有最大的吸光度[17]，吸光度值越大說明樣品還原能力越強。由圖1可知，在實驗質(zhì)量濃度（0.5～2.5 mg/ mL）范圍內(nèi)，還原力（Y）與羅非魚肉蛋白酶解液質(zhì)量濃度（x，mg/mL）呈線性關(guān)系，回歸方程為Y = 0.016 6－0.190 8x（R2=0.993 8）。

圖1 羅非魚肉蛋白酶解液的還原力Fig.1 Reducing power of tilapia protein hydrolysate

圖2 羅非魚肉蛋白酶解液清除DPPH自由基的能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of tilapia protein hydrolysate

自由基與機體的許多功能障礙和疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1,14]。體內(nèi)過多的活性氧能與氨基酸、蛋白質(zhì)和DNA等生物分子發(fā)生反應(yīng)，造成身體疾病[18]?？寡趸瘎┠芘c自由基發(fā)生反應(yīng)，生成穩(wěn)定的物質(zhì)。因此，探討羅非魚肉蛋白酶解液對DPPH自由基、·OH和O2－·的清除作用具有重要意義。如圖2所示，羅非魚肉蛋白酶解液對DPPH自由基的清除率隨著羅非魚肉蛋白酶解液質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大，清除率在12.4%～76.2%，兩者呈正相關(guān)；羅非魚肉蛋白酶解液質(zhì)量濃度在0.5～2 mg/mL時，兩者線性關(guān)系良好；當質(zhì)量濃度大于2 mg/mL時，DPPH自由基清除效果變化不明顯。羅非魚肉蛋白酶解液對·OH清除率的變化趨勢與其清除DPPH自由基相似（圖3），其清除DPPH自由基和·OH的半數(shù)有效質(zhì)量濃度（EC50）分別為1.57、1.68 mg/mL。如圖4所示，羅非魚肉蛋白酶解液清除O2–·的能力較弱，EC50僅為2.76 mg/mL。

圖3 羅非魚肉蛋白酶解液清除·OH的能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging activity of tilapia protein hydrolysate

圖4 羅非魚肉蛋白酶解液清除的能力Fig.4 Superoxide anion radical scavenging activity of tilapia protein hydrolysate

2.2 體內(nèi)抗氧化活性分析

D-半乳糖衰老模型被廣泛用于衰老機理研究和抗氧化劑、延緩衰老藥物的藥效學評價[5]。自由基導致脂質(zhì)過氧化而產(chǎn)生MDA，SOD活力、GSH-Px活力和T-AOC是體內(nèi)生物防護體系中最重要的抗氧化指標，可清除體內(nèi)的自由基。由表1、圖5、6可知，正常對照組血清、肝臟組織中SOD活力、T-AOC均顯著高于模型對照組（P＜0.05）。高劑量組血清和肝臟組織中SOD活力、GSH-Px活力和T-AOC不僅顯著高于其相對應(yīng)的模型對照組，而且顯著高于其相對應(yīng)的正常對照組（P＜0.05）。GSH-Px對和機體組織產(chǎn)生的·OH及H2O2有較強的清除能力，可減輕脂質(zhì)由于過氧化對機體組織的造成的損傷，由此推斷，高劑量羅非魚蛋白酶解液在預(yù)防衰老方面有重要的作用。

表1 羅非魚肉蛋白酶解液對小鼠血清SOD、GSH-Px活力、T-AOOCC和MDA含量的影響（x±s，n=10）Table 1 Effect of tilapia protein hydrolysate on SOD and GSH-Px activities, MDA level and T-AOC in mouse serum（x ±s,, n = 10）

圖5 羅非魚肉蛋白酶解液對小鼠肝臟SOD、GSH-Px活力的影響（x±s，n=10）Fig.5 Effect of tilapia protein hydrolysate on the activities of SOD and GSH-Px in mouse liver (x ±s, n = 10)

圖6 羅非魚肉蛋白酶解液對小鼠肝臟T-AOC的影響Fig.6 Effect of tilapia protein hydrolysate on T-AOC in mouse liver

體內(nèi)過量自由基會侵害細胞膜中不飽和脂肪酸，形成過氧化脂質(zhì)。脂質(zhì)過氧化物的降解產(chǎn)物MDA可與氨基酸和蛋白質(zhì)等反應(yīng)形成脂褐素，使得蛋白質(zhì)破壞變性蓄積于胞漿，最終使細胞發(fā)生變形壞死[19]。MDA含量的檢測可以反映細胞脂質(zhì)過氧化的程度。從表1和圖7可以看出，對照組血清和肝臟組織中的MDA含量顯著低于模型對照組。3個劑量組的小鼠血清和肝臟組織中MDA含量均低于模型對照組，低、中、高劑量血清中MDA含量分別降低了18.9%、34.7%、35.5%，低、中、高劑量組肝臟組織中MDA含量分別較模型對照組降低了32.6%、35.4%、42.0%。說明羅非魚肉蛋白酶解液具有抗氧化活性，并且呈一定的量效關(guān)系。

圖7 羅非魚肉蛋白酶解液對小鼠肝臟MDA含量的影響Fig.7 Effect of tilapia protein hydrolysate on MDA level in mouse liver

2.3 肝臟組織及血清中T-AOC/MDA比值

圖8 小鼠肝臟組織及血清中T-AOC/MDA比值Fig.8 T-AOC/MDA ratios in mouse serum and liver

T-AOC/MDA比值能夠較好的反映體內(nèi)抗氧化/氧化平衡狀態(tài)[20]。由圖8可知，肝臟和血清中高劑量組中T-AOC/ MDA比值均顯著高于低劑量組和模型對照組。其中，血清中高劑量組T-AOC/MDA比值約為模型對照組的300%，高劑量組明顯優(yōu)于低劑量組（P＜0.05），這對穩(wěn)定、持續(xù)地保持體內(nèi)抗氧化作用將起到積極的促進作用。

3 結(jié) 論

羅非魚肉蛋白酶解液具有較高的還原力和自由基清除能力，可以顯著提高D-半乳糖衰老模型小鼠血清和肝臟組織中的SOD、GSH-Px活力和T-AOC，降低血清及肝臟組織MDA含量，高劑量羅非魚肉蛋白酶解液對小鼠體內(nèi)抗氧化/氧化平衡狀態(tài)有明顯的穩(wěn)定作用。因此羅非魚肉蛋白酶解液的整體抗氧化性能較好，有必要研究將其開發(fā)成天然抗氧化劑或自由基清除劑。

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Preparation of Tilapia (Oreochromis niloticus) Protein Hydrolysate and Analysis of Its Antioxidant Activity in vitro and in vivo

WANG Qiang, LI Gui-jie, ZHAO Xin, REN Yan-rong
(Department of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China)

Tilapia (Oreochromis niloticus) protein hydrolysate was prepared with papain. Its antioxidant activities at different doses were evaluated in vitro and in vivo using reducing power, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl (DPPH), hydroxyl and superoxide anion radical scavenging assays and D-galactose-induced mouse aging model. The reducing power of the hydrolysate was high. The EC50values in the DPPH radical, hydroxyl and superoxide anion radical scavenging assays were 1.57, 1.68 and 2.76 mg/mL, respectively. The hydrolysate could significantly increase the activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) and total antioxidative capacity (T-AOC) in the serum and liver of aging mice (P ＜ 0.05). Furthermore, the content of malondialdehyde (MDA) in serum and liver displayed a reducing trend (P ＜ 0.05). In conclusion, the tilapia protein hydrolysate has a good antioxidant effect in vitro and vivo as expected.

tilapia; hydrolysate; antioxidant activity in vivo; D-galactose-induced mouse aging model

TS254.1

A

1002-6630（2014）05-0199-05

10.7506/spkx1002-6630-201405039

2013-04-13

重慶市教委科學技術(shù)研究項目（KJ121504）；重慶高校創(chuàng)新團隊建設(shè)計劃資助項目（KJTD201325）

王強（1982—），男，副教授，碩士，研究方向為油脂化學及抗氧化生物資源生理生化。E-mail：wangqiang8203@163.com