徐超蓮，賴衛(wèi)華*，劉道峰

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

膠體金免疫層析法檢測食品中天然存在的危害物質的研究進展

徐超蓮，賴衛(wèi)華*，劉道峰

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

膠體金免疫層析法是一種簡易、快速的檢測方法，現(xiàn)已廣泛應用于食品安全檢測、生物醫(yī)學診斷等許多領域。食品中的有害成分可分為人為添加和天然存在的兩部分。本文綜述了膠體金免疫層析法在食品中天然存在的危害物質快速檢測中的應用，并對其發(fā)展前景進行展望。

膠體金；免疫層析；食品安全；天然危害物質

目前，以膠體金為示蹤物應用于抗原抗體反應的免疫層析方法已廣泛地應用于食品安全的快速檢測。膠體金是由氯金酸在還原劑如檸檬酸三鈉、抗壞血酸、檸檬酸鈉、鞣酸等的作用下聚合成一定大小的金顆粒，并在靜電作用下形成穩(wěn)定的膠體狀態(tài)[1]。因為膠體金具有肉眼可見的紅色，當抗原與抗體結合部位的金顆粒達到一定數(shù)量時，便可觀察到紅色條帶，通過紅色條帶即可判斷檢測結果。通常實際檢測根據具體情況可以采用兩種不同的方式：雙抗夾心法和競爭法。以膠體金為免疫標記物方法的優(yōu)點是操作簡單、價格低廉、成本較低、特異性和靈敏度較高、肉眼易判斷、檢測時間短，特別適合廣大基層和大批量現(xiàn)場檢測。

膠體金獨特的理化特性及作為標記物的獨特優(yōu)點，使其在食品安全檢測、生物醫(yī)學診斷等各個領域得到了廣泛地應用，且膠體金試紙條的產業(yè)化已規(guī)模化且產品日益成熟。近年來，食品生產的工業(yè)化和工業(yè)發(fā)展帶來的污染使得因此而起的食品安全重大事件引起國際社會的廣泛關注。然而，除了人工合成的化學物質的非法添加等造成的污染外，食品中天然存在的危害物質：食源性致病菌、生物毒素、過敏原及環(huán)境中的重金屬，更是引起食品安全問題頻繁發(fā)生的重要因素。本文從膠體金免疫層析法在食品中天然存在的危害物質快速檢測中的研究應用展開綜述。

1 膠體金免疫層析法快速檢測食源性致病菌

食源性致病菌主要有沙門氏菌、大腸桿菌O157∶H7、志賀菌、單增李斯特菌等?？v觀全球各地，由食源性致病菌引起的食物中毒已經成為當前世界上最突出的食品安全問題。據報道，全球每年發(fā)生40～60億例食源性疾病，發(fā)展中國家每年約有180萬人口死于食源性疾病，即使是在發(fā)達國家，每年亦有10%以上的人群感染食源性疾病[2]。1996年日本發(fā)生了世界上規(guī)模最大、涉及6 300名學生的大腸桿菌O157∶H7食物中毒，死亡2人[3]，全球已有6大洲30多個國家報道有該菌所致的感染流行[4]。單增李斯特氏菌其主要的傳染源是動物性食品，據美國疾病預防控制中心（Centers for Disease Control，CDC）報道，美國每年約有600～2 000例病人，死亡約450人[5]。2010年日本4 090個養(yǎng)雞場中抽取203個調查，48個顯示大氣浮塵感染沙門氏菌，感染率達23.6%[6]。最近一項食源性疾病主動監(jiān)測顯示，我國平均6個半人中就有1人次罹患食源性疾病。食源性疾病已成為我國頭號食品安全問題[7]。目前，檢測食源性致病菌的主要方法之一是免疫層析法，其中基于雙抗夾心原理的膠體金免疫層析法在檢測食源性致病菌領域的發(fā)展已比較成熟，特別是針對于大腸桿菌O157、沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌等致病菌已有較多的研究報道，具體見表1。

表1 膠體金免疫層析法在食源性致病菌的檢測應用進展Table 1 Application of colloidal gold immunochromatography assay in the detection of foodborne pathogens

從近幾年的文獻報道看，國內外關于膠體金免疫層析法檢測食源性致病菌在大腸桿菌O157、沙門氏菌、單增李斯特菌的研究應用較多。其膠體金免疫層析試紙條采用的標記抗體主要有單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體雖然制備周期較長、價格較貴，但在檢測食源性致病菌時其靈敏度比多克隆抗體稍高[26]，如黃嶺芳等[9]采用單克隆抗體為標記抗體制備的大腸桿菌O157的膠體金免疫層析試紙條，檢測限為104CFU/mL，比采用多克隆抗體的膠體金免疫層析試紙條低100倍[27]。可見，采用在純度相當?shù)臈l件下采用親和力強的單克隆抗體可以提高食源性致病菌的檢測靈敏度和特異性。此外，有些研究還在此基礎上，結合了免疫磁珠富集技術或生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)，提高其檢測靈敏度：如Qi Hui等[11]用免疫層析法結合免疫磁珠富集技術快速檢測大腸桿菌O157，靈敏度為103CFU/mL，比直接用免疫層析法檢測靈敏度提高了2個數(shù)量級[8]；Zhao Xihong等[10]基于生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)制備膠體金免疫層析試紙條檢測大腸桿菌O157，檢測食品中10倍稀釋的O157，最低限度為2.3×103CFU/mL，經富集后檢測限度達2.3 CFU/mL。隨著檢測能力不斷提高，膠體金免疫層析試紙條也趨向定量檢測和多元檢測發(fā)展。例如，謝士嘉等[12]建立了膠體金試紙條-膠體金生物傳感器有機整合的膠體金定量檢測系統(tǒng)檢測單增李斯特菌，在人為肉眼判斷3.5×104CFU/mL的基礎上提高了檢測的敏感性，定量檢測靈敏度為3.5×103CFU/mL，線性范圍3.5×103～3.5×108CFU/mL，回收率在99%～101.7%之間；王衛(wèi)杰[28]建立了同時檢測E.coli O157∶H7和Salmonella Tyhpimurium的免疫層析技術，同時檢測時檢測限為105CFU/mL，可以提高檢測效率，降低檢測成本，對需要多個指標聯(lián)檢物質的檢測具有很大的應用價值[29]。但目前，關于食源性致病菌多元檢測的文獻報道較少，可以借鑒其他物質多元檢測的思路，研制出食源性致病菌聯(lián)檢的膠體金試紙條。

2 膠體金免疫層析法快速檢測生物毒素

生物毒素也是食品安全檢測中不可忽視的問題，它主要包括貝類毒素和真菌毒素。

2.1 貝類毒素

貝類毒素屬于海洋天然有機物，其形成與海洋有毒藻類赤潮密切相關。有毒藻類產生的毒素通過食物鏈進入貝類體內，形成貝類毒素，而人們食用含貝類毒素的貝類產品會造成食物中毒。常見的貝類毒素有麻痹性貝毒、神經性貝毒、記憶缺失性貝毒和腹瀉性貝毒[30]。自1967年以來，我國共發(fā)生有記載的貝類中毒事件47起，29人死亡，604人中毒后需入院治療，中毒事件主要發(fā)生在我國的福建、臺灣、浙江、廣東沿海[31]。近幾年來，我國貝類中毒事件頻繁發(fā)生，貝類毒素已經成為環(huán)境和食品安全的嚴重問題，尋求一種快速篩查海產品中貝類毒素的方法尤為迫切。目前國內外已有應用膠體金技術檢測海水或海產品中甲藻毒素、麻痹性貝毒、腹瀉性貝毒等方面的報道，其檢測原理主要為競爭抑制免疫反應。

Zhou Yu等[32-33]建立一步免疫層析法快速檢測水產品樣本中的雙鞭甲藻毒素（PbTxs）和河豚魚組織中的河豚毒素，靈敏度分別為20 ng/mL和40 ng/mL，適于現(xiàn)場快速檢測。高利利等[34]制備軟骨藻酸（domoic acid，DA）膠體金免疫層析快速檢測試紙條，能快速檢測貝類食品中軟骨藻含量，檢測靈敏度為20 ng/mL。Liu Renyan等[35]研制了快速檢測軟海綿酸（okadaic acid，OA）的膠體金試紙條，其檢出限為12 ng/mL。此外，Lu Shiying等[36]也建立了一種現(xiàn)場快速篩查軟海綿酸的膠體金試紙條，定性檢測限為150 μg/kg，其結果與應用高效液相色譜法-質譜聯(lián)用儀/質譜聯(lián)用儀（high performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，HPLC-MS/MS）保持一致。由于高純度的毒素制備困難，價格昂貴，將毒素與載體蛋白偶聯(lián)技術難度較大，國內外相關研究起步較晚，水平較滯后，受抗貝毒有毒成分的單克隆抗體的制備水平的限制，膠體金免疫層析法檢測貝毒的研究還有很大的提升空間。

2.2 真菌毒素

真菌毒素是一些真菌在生長過程中所產生的次級代謝產物，幾乎廣泛地存在于所有的食品和飼料中，危害人類和動物的健康安全。目前研究較多、對人類危害較大的真菌毒素包括黃曲霉毒素（主要是AFB1和AFM1）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、伏馬菌素（fumonisin，F(xiàn)B）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）等，具有毒性強、污染頻率高的特點，可致癌、致畸、致突變。據報道[37]，全球每年由于霉變、污染真菌毒素引起的農產品和工業(yè)原料的損失達數(shù)百億。據聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織統(tǒng)計，全世界每年約有25%的谷物受真菌毒素污染。鑒于真菌毒素給糧油食品產業(yè)帶來的巨大損失，相關檢測技術已展開了廣泛的研究，尤其是適于大批量現(xiàn)場快速篩查的膠體金免疫層析技術。目前，膠體金免疫層析法已廣泛應用于真菌毒素的檢測中。由于真菌毒素是小分子化合物，研制的免疫層析試紙條均采用的是競爭免疫層析原理，具體見表2。

表2 膠體金免疫層析法在真菌毒素檢測中的應用進展Table 2 Application of colloidal gold immunochromatography assay in the detection of mycotoxins

真菌毒素不僅對人和動物具有多種特定器官的毒性及致癌性，而且價格昂貴，研究一種能夠替代真菌毒素的標準品的檢測元件可能是未來真菌毒素檢測發(fā)展的一個趨勢。目前，針對真菌毒素半抗原的研究包括抗原模擬表位肽和抗獨特型抗體[55]。Lai Weihua等[46]將噬菌體展示的OTA模擬表位應用于膠體金免疫層析試紙條，建立了一種安全快速的OTA的檢測方法，檢測限為10 ng/mL，該方法解決了真菌毒素標品來源受限的問題，為其他真菌毒素的無毒檢測提供了新的思路。此外，應用膠體金試紙條實現(xiàn)2種甚至是多種真菌毒素的同時檢測也將是一個有價值的研究熱點。近一兩年來，國內外關于這方面的研究報道已比較廣泛。Wang Yuankai等[52]建立了同時檢測ZEN和FB1的膠體金免疫層析法，實現(xiàn)了食品樣本的多種毒素的聯(lián)檢，為其他食品有害物質的多元檢測提供了參考方法。

3 膠體金免疫層析法快速檢測環(huán)境中存在的重金屬

重金屬是相對密度在5以上的金屬，對環(huán)境造成污染的重金屬主要是指汞、鎘、鉛、鉻以及類金屬砷等生物毒性顯著的重金屬元素。土壤、水體等環(huán)境中重金屬污染可通過食物鏈富集而對食品安全構成威脅，在人體內積累達到一定程度，會造成慢性中毒。迄今為止，我國發(fā)生了多起重金屬污染事件，因此國家出臺的“十二五”規(guī)劃提出對飲用水安全、重點流域水污染防治、重金屬治理等一系列措施，重金屬含量快速檢測的需要越來越迫切。目前，國內外膠體金免疫層析法在檢測重金屬方面的應用比較少，只有在檢測水樣中的鎘、鉻、銅和鉛有關報道，如表3所示。

表3 膠體金免疫層析法在環(huán)境中重金屬的檢測應用進展Table 3 Application of colloidal gold immunochromatography assay in the detection heavy metals

膠體金免疫層析法在檢測重金屬中標記抗體基本上采用都是抗重金屬-EDTA螯合物單克隆抗體，如劉斌等[57]建立的快速檢測環(huán)境水樣中重金屬鎘殘留的膠體金免疫層析法，靈敏度可達5 μg/L。而黃婧[61]在國內外首次提出了將重金屬依賴的核酸酶和膠體金免疫層析技術結合的創(chuàng)新思想，并研制了檢測銅和鉛的膠體金傳感器，靈敏度為10 nmol/L和500 nmol/L，對環(huán)境中重金屬離子的檢測具有重要的借鑒研究意義。

4 膠體金免疫層析法快速檢測過敏原

全球性轉基因食品的侵襲和過敏癥發(fā)病率的逐年增高，導致食品過敏已成為重要的食品安全問題。食物中過敏原主要分為植物性過敏原、動物性過敏原、轉基因食物過敏原。日常生活中常見的引起過敏反應的食物有：花生、牛奶、海產品類、蛋類。由食品或食品成分引起的危害健康的過敏反應會發(fā)生在大約1%～3%的人群和4%～6%的小孩中[64]。而且發(fā)達國家超過20%的人受過敏性疾病的困擾，因此對進口食品過敏原標簽的要求越來越嚴格[65]。所以，開發(fā)快速、簡便、靈敏、特異的過敏原成分篩查的免疫層析方法十分必要。目前，國內外檢測過敏原主要采用酶聯(lián)免疫吸附方法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），利用膠體金免疫層析法檢測的相關文獻報道非常少，許多相關的研究尚待開展。Ji Kunmei等[66]建立了雙位點單克隆抗體膠體金免疫層析法檢測花生過敏原Ara h 1。其對標準花生樣品的靈敏度為10 ng/mL。Chen Jiajie等[67]建立了一種實用的篩查和鑒定食品中花生過敏原的檢測系統(tǒng)，膠體金試紙條篩出陽性樣本后用免疫印跡檢測確認。由于食物過敏原成分在加熱和加壓等加工過程中可能會發(fā)生蛋白質變性，給以抗原抗體特異性反應的免疫層析檢測方法帶來難題，很多問題還有待解決。

5 結 語

從近年來的文獻報道來看，國內的膠體金免疫層析法在食品安全中的應用主要還是集中在檢測獸藥殘留、農藥殘留、三聚氰胺等非法添加或過量添加方面，在天然存在的危害物質的檢測方面應用相對較少?？梢韵胂?，隨著技術的進步及各方對食品安全重視程度的增強，未來非法添加與濫用造成的食品安全威脅將逐步減少，而食品中天然存在的危害物質必將成為食品安全的關注點。

膠體金免疫層析技術作為一種新型的免疫學快速診斷和檢測技術，具有需樣微量、特異性強、操作簡便、檢測時間短等優(yōu)點，適合基層和現(xiàn)場大批量快速檢測。但是在實際檢測應用中依然存在一些需要改進和優(yōu)化的條件。首先為放大特異性抗原抗體的反應信號，增強膠體金的顯色效果，可采用生物素親和鏈霉親和素系統(tǒng)或免疫金銀染色法（immunogold silver staining，IGSS）等措施，并結合一些相應的生物傳感器、電化學設備來拓寬其檢測范圍。其次可采用多膜復合或單膜多元受體固定2種方式，一次檢測可同時得到多組結果，節(jié)省檢測時間及成本，這對于檢測某些具有聯(lián)檢意義的物質具有很大的應用價值。此外，目前膠體金試紙條的檢測結果的判斷大多通過目測顯色情況，只能定性或半定量檢測，可能存在較大的誤差。為了減小誤差，迫切地需要研制出一種定量化的讀取儀器。

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Progress in the Detection of Naturally Occurring Hazardous Substances in Foods by Colloidal Gold Immunochromatography Assay

XU Chao-lian, LAI Wei-hua*, LIU Dao-feng
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Colloidal gold immunochromatography assay is a simple and fast immunological detection technology and is now widely applied in many fields including food safety detection, biomedical diagnosis, and so on. The food-derived hazardous substances are classified into either artificially added or naturally occurring.includeman-added additives and ly existing hazards In this article, the application of colloidal gold immunochromatography assay in the detection of the naturally ing occurring hazardous substances is reviewed. The further development of the immunochromatography assay is prospected as well.

colloidal gold; immunochromatography; food safety; natural hazardous substances

TS207

A

1002-6630（2014）05-0257-05

10.7506/spkx1002-6630-201405050

2012-12-11

江西省主要學科學術和技術帶頭人培養(yǎng)計劃項目（20113BCB22007）；江西省教育廳落地項目（KJLD13009）；

江西省生豬產業(yè)質量安全崗位專家項目（JXARS-03）

徐超蓮（1988—），女，碩士研究生，研究方向為食品工程。E-mail：chaochaoncu@163.com

*通信作者：賴衛(wèi)華（1968—），男，教授，博士，研究方向為食品科學。E-mail：talktolaiwh@163.com