劉貴珊，楊 博，張澤生*，范艷麗，賀 偉

（1.寧夏大學農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021；2.天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津 300457；3.寧夏大學新華學院，寧夏 銀川 750021）

白藜蘆醇對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力和腦組織抗氧化能力的影響

劉貴珊1,2，楊 博3，張澤生2,*，范艷麗1，賀 偉2

（1.寧夏大學農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021；2.天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津 300457；3.寧夏大學新華學院，寧夏 銀川 750021）

探討白藜蘆醇對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織抗氧化與學習記憶的影響，揭示白藜蘆醇延緩腦衰老的作用。將50只雄性ICR鼠隨機分為正常對照組，模型組，白藜蘆醇低、中、高劑量組。模型組及白藜蘆醇治療組連續(xù)8周于小鼠頸背部皮下注射D-半乳糖120 mg/（kg·d），給予不同劑量白藜蘆醇（25、50、100 mg/（kg·d））灌胃；正常對照組注射、灌胃等量生理鹽水。采用Morris水迷宮檢測各組小鼠的學習記憶能力，并測定各組小鼠腦組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量。白藜蘆醇能夠顯著縮短D-半乳糖致衰老小鼠Morris水迷宮中找到隱藏平臺時間（P＜0.01），提高游泳速度（P＜0.01）和穿越目標象限的次數(shù)（P＜0.01）；提高衰老模型小鼠腦組織SOD（P＜0.01）、T-AOC活性（P＜0.05），降低MDA含量（P＜0.01）。白藜蘆醇能夠改善D-半乳糖致衰老模型小鼠的學習記憶能力，提高腦組織的抗氧化能力，具有一定延緩腦衰老的作用。

白藜蘆醇；D-半乳糖；學習記憶能力；抗氧化

隨著人類平均預期壽命的不斷延長，世界人口結(jié)構(gòu)的老齡化趨勢日益突顯，一個人口老齡化的時代已經(jīng)來臨[1]。衰老又稱老化，通常是指在正常狀況下生物發(fā)育成熟后，隨年齡增加，自身機能減退，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定能力與應激能力下降，結(jié)構(gòu)、組分逐步退行性變，趨向死亡，不可逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。研究和闡明衰老機理，延緩人類衰老進程，提高生存質(zhì)量，具有重要的醫(yī)學價值和社會意義。因此，關于衰老和抗衰老的研究已成為21世紀世界生命科學研究的熱點之一。

白藜蘆醇（resveratrol，Res），化學名為3,4’,5-三羥基-反式-二苯乙烯（3,4’,5-trihydroxy-trans-stilbene），是廣泛存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中的一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚類化合物，以新鮮葡萄皮中含量最高。研究表明，白藜蘆醇具有抗癌[2]、抗菌[3]、抗炎[4-5]、保肝[6]、植物雌激素樣作用[7]、心血管系統(tǒng)的保護作用[8]等多種生物學活性，但其抗氧化與抗衰老作用的研究卻鮮見報道。本課題組之前對白藜蘆醇的體外抗氧化作用進行了研究[9]，本研究采用D-半乳糖致衰老模型小鼠，探討白藜蘆醇對其學習記憶能力以及腦組織抗氧化能力的影響，旨在評價白藜蘆醇的抗衰老作用及其機制，從而為深入開發(fā)白藜蘆醇保健產(chǎn)品提供理論和技術(shù)基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

白藜蘆醇（純度97%） 天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)公司；D-半乳糖 上海藍季科技發(fā)展有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒、總抗氧化力（total antioxidant capacity，T-AOC）測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒 南京建成生物工程中心；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

DFT-200手提式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；DZKW-0-2電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；MK3酶標儀、冷凍離心機 美國Thermo公司；Morris水迷宮 中國醫(yī)學科學院藥物研究所。

1.2 動物分組及處理

SPF級8周齡雄性ICR小鼠50只，體質(zhì)量（24±2）g，由天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心提供（合格證號：W-J津?qū)崉淤|(zhì)M準字第006號）；動物飼養(yǎng)在天津科技大學清潔級動物實驗房（環(huán)境設施合格證號：SYXK（津）2006-0005）。

小鼠飼養(yǎng)在室溫為18～22℃，相對濕度50%～60%，1 2 h晝夜交替的動物房內(nèi)，自由攝食和飲水。適應1周后，用Morris水迷宮篩選游泳距離不低于2 600 cm/2 min、體質(zhì)量不低于18 g的50只健康雄性ICR小鼠。按隨機區(qū)組設計分為5組，即正常對照組（normal group，NG）、模型組（model group，MG）、白藜蘆醇低劑量組（low dose of resveratrol-treated group，RESL）、白藜蘆醇中劑量組（moderate dose of resveratrol-treated group，RESM）、白藜蘆醇高劑量組（high dose of resveratrol-treated group，RESH），每組10只。除正常對照組外，其余4組均頸背部皮下注射用生理鹽水配制的滅菌D-半乳糖120 mg/（kg·d），正常對照組注射等量生理鹽水，連續(xù)8周。同時，白藜蘆醇低、中、高劑量組分別以25、50、100 mg/（kg·d）劑量灌胃白藜蘆醇（1%羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC）助溶）的生理鹽水溶液，正常對照組和模型組灌胃等量生理鹽水。實驗期間每周稱質(zhì)量1次，并根據(jù)小鼠體質(zhì)量變化調(diào)整灌胃劑量和注射劑量。

1.3 腦組織抗氧化指標的測定

末次給藥后禁食12 h，將各組小鼠脫臼處死，迅速取右側(cè)大腦組織（在冰面上操作），制成10%組織勻漿，測定腦組織SOD、T-AOC活力和MDA的含量。

1.4 Morris水迷宮行為測試實驗

Morris圓形水迷宮主要由圓形不銹鋼水池（直徑120 cm，高50 cm）和隱藏平臺（直徑9 cm，高27 cm）組成，水池上空通過一個數(shù)字攝相機與計算機相連接。實驗時將水池內(nèi)的水用黑色墨汁染色，以隱藏平臺，水面高出平臺表面1 cm，水溫控制在（22±0.5）℃。整個實驗過程分為隱藏平臺獲得實驗和空間探索實驗兩部分[10-12]。各組小鼠末次給藥前6 d Morris水迷宮訓練。

隱藏平臺獲得實驗：旨在評價小鼠的學習和記憶能力。實驗開始前，讓小鼠自由游泳2 min以適應周圍環(huán)境。正式實驗開始時，隨機從東、西、南、北4個入水點選擇一個，將小鼠面向池壁放入水中，記錄其尋找并爬上平臺所需時間即逃避潛伏期。如果小鼠在120 s內(nèi)未找到平臺，將其引至平臺，逃避潛伏期記為120 s；若小鼠找到平臺，需停留20 s。實驗歷時4 d，每天每只小鼠訓練4次，共訓練16次。計算每天各組4次尋找平臺潛伏期和游泳速度的平均值記為當天的尋找平臺潛伏期和游泳速度[13]。

空間探索實驗：旨在評價小鼠空間位置記憶保持的能力。實驗第5天去除平臺，任選一個入水點將小鼠放入水中，記錄120 s內(nèi)，小鼠在目標象限（原平臺所在象限）穿越目標次數(shù)，記為穿越次數(shù)[14]。

1.5 統(tǒng)計方法

各組隱藏平臺實驗指標用SPSS13.0進行重復測量的數(shù)據(jù)分析，各組空間探索實驗，腦組織SOD、T-AOC、MDA檢測進行多個樣本均數(shù)的方差分析以及均數(shù)間兩兩比較，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇對D-半乳糖致衰老小鼠一般狀態(tài)觀察

觀察結(jié)果表明：正常對照組小鼠飲食正常，行動敏捷，毛色光亮，皮膚有彈性，精神狀態(tài)良好；與正常對照組比較，模型組則精神萎靡，瞇眼，扎堆，皮膚粗糙，反應遲鈍，毛色暗淡，尤其是腹部毛發(fā)逐漸變得無光澤、稀疏并漸有脫毛現(xiàn)象；白藜蘆醇低、中、高劑量組小鼠在行動、皮膚及毛發(fā)狀態(tài)方面均較模型組好。

2.2 白藜蘆醇對小鼠體質(zhì)量的影響

表1 實驗期間小鼠體質(zhì)量變化（x±s，n=10）Table 1 Changes in mouse body weight during the experiment (x ±s，n = 10) g

小鼠的體質(zhì)量增長情況是反應生長發(fā)育的一個重要指標，每周測定一次小鼠的體質(zhì)量。如表1所示，各實驗組小鼠在實驗初期的平均體質(zhì)量基本相同，組間無顯著差異（P＞0.05）。通過灌胃白藜蘆醇后，對各組、各時間點小鼠體質(zhì)量變化方差分析結(jié)果顯示：各組間小鼠體質(zhì)量無顯著性差別（P＞0.05），組別與時間點間無交互作用，說明白藜蘆醇對小鼠的生長發(fā)育無不良影響。給藥1周后，小鼠體質(zhì)量普遍下降的原因可能是由于灌胃操作對食道黏膜有一定刺激，影響到小鼠的食欲，造成體質(zhì)量下降，但經(jīng)過一定的適應期，小鼠體質(zhì)量又有所回升。

2.3 白藜蘆醇對小鼠隱蔽平臺實驗逃避潛伏期和游泳速度的影響

圖1 Morris水迷宮的4 d隱藏平臺獲得性訓練測試中，白藜蘆醇對小鼠尋找平臺潛伏期的影響Fig.1 Dose-dependent effects of resveratrol on latency to find the platform during the 4-dayhidden-platform acquisition training in Morris water maze in mice model

由圖1可知，在4 d隱藏平臺獲得性訓練測試中，模型組逃避潛伏期均明顯長于正常對照組（P＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇低、中、高劑量組從第2天開始逃避潛伏期明顯縮短，至第4天作用最明顯（P＜0.01），并且作用隨劑量增加而增強，說明白藜蘆醇對D-半乳糖誘導的衰老小鼠的學習記憶能力具有改善和促進作用。

圖2 Morris水迷宮的4 d隱藏平臺獲得性訓練測試中，白藜蘆醇對小鼠游泳速度的影響Fig.2 Dose-dependent effect of resveratrol on swimming speed during the 4-day hidden-platform acquisition training in Morris water maze in mice model

如圖2所示，4 d隱藏平臺獲得性訓練測試中，白藜蘆醇對小鼠游泳速度的影響。與模型組相比，正常對照組游泳速度明顯加快（P＜0.05）；白藜蘆醇中劑量組和高劑量（P＜0.01）組也快于模型組。上述結(jié)果表明，隨著白藜蘆醇劑量的增大，游泳速度加快；說明白藜蘆醇能增強D-半乳糖致衰老小鼠的體能和適應能力，提高小鼠的學習記憶能力。

2.4 白藜蘆醇對小鼠空間探索實驗的影響

圖3 Morris水迷宮的空間搜索測試中，白藜蘆醇對小鼠穿越目標象限次數(shù)的影響Fig.3 Dose-dependent effect of resveratrol on the number of times mice crossed the platform during spatial probe trial in MWM in mice model

第5天撤掉平臺后，測試5組小鼠的空間探索能力。由圖3可知，小鼠穿越目標象限次數(shù)存在組間差異。與模型組相比，對照組穿越次數(shù)顯著增多（P＜0.05）；3個白藜蘆醇劑量組的小鼠在目標象限的穿越次數(shù)顯著增多，尤其中劑量組（P＜0.05）和高劑量組（P＜0.01），提示白藜蘆醇對小鼠記憶能力的改善隨著劑量增加而療效有增強的趨勢。

2.5 白藜蘆醇對小鼠腦組織抗氧化指標的影響

由表2可知，與正常對照組相比，D-半乳糖誘導的衰老模型組小鼠腦組織中SOD活力顯著下降（P＜0.05）；T-AOC活力雖然有所降低，但無顯著性（P＞0.05）；MDA含量顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，白藜蘆醇治療組的SOD活力顯著提高，尤其高劑量組（P＜0.01）；白藜蘆醇低、中、高劑量組的T-AOC活性顯著提高（P＜0.05）；白藜蘆醇治療組的MDA含量降低，尤其中、高劑量組（P＜0.01）的MDA含量顯著降低。以上結(jié)果說明白藜蘆醇具有抑制脂質(zhì)過氧化，延緩衰老的作用。

表2 白藜蘆醇對小鼠腦組織中SOD、T-AOC活力和MDA含量的影響（x ±s，n=10）Table 2 Effects of resveratrol on SOD activity and the contents of T-AOC and MDA in the brain of aged mice (x± s，n = 10)

3 討 論

D-半乳糖建立的衰老模型是目前國內(nèi)較常應用的衰老和腦老化動物模型，其衰老反應接近于自然衰老。研究表明[15]，D-半乳糖造成的衰老模型可使實驗動物出現(xiàn)認知功能障礙。本實驗所采用的Morris水迷宮行為模型是英國心理學家Morris于20世紀80年代初設計并應用于腦學習記憶機制研究的一種實驗方法，廣泛應用于神經(jīng)藥理學、神經(jīng)生理學、神經(jīng)心理學、老年病學等的研究中。該裝置通過實驗動物游泳的方式，學習尋找隱藏在水中的平臺，獲得豐富的數(shù)據(jù)諸如穿越平臺的次數(shù)、潛伏期、游泳速度等參數(shù)，從而評價實驗動物的空間學習記憶能力[16]。

本研究結(jié)果表明，各組小鼠逃避潛伏期隨著游泳天數(shù)的增加而逐漸縮短，說明各組小鼠在4 d游泳訓練中對于尋找平臺均有一定的學習記憶能力，但其學習記憶能力有很大差異。模型組大鼠Morris水迷宮潛伏期4 d內(nèi)下降很慢，游泳速度較慢，與正常對照組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明模型組小鼠學習記憶能力嚴重受損。通過白藜蘆醇的干預，白藜蘆醇的低、中、高劑量組小鼠較模型組小鼠逃避潛伏期縮短（P＜0.01），游泳速度加快（P＜0.01），穿越目標象限的次數(shù)增加（P＜0.01），表明白藜蘆醇對D-半乳糖所致衰老模型小鼠的學習記憶障礙具有改善作用。

D-半乳糖致衰老小鼠模型中過量的氧自由基使細胞膜脂質(zhì)受損，導致腦組織中清除自由基酶類SOD、T-AOC的活性下降及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA升高等[17]。SOD是生物體內(nèi)清除活性氧的抗氧化酶，它可清除自由基，減輕和阻斷脂質(zhì)過氧化，保護機體免受自由基的損傷，延續(xù)細胞的衰老[18-19]；T-AOC是反應機體防御體系抗氧化能力強弱的重要指標之一[20]；MDA是過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物，它產(chǎn)量的多少可表示過氧化程度的大小[21-22]。本研究表明：D-半乳糖致衰老小鼠腦組織中SOD、T-AOC活性下降，MDA含量增加。分別給予25、50、100 mg/（kg·d）白藜蘆醇灌胃后能使衰老模型小鼠腦組織SOD及T-AOC的活性不同程度升高，MDA含量下降。表明白藜蘆醇能提高衰老小鼠腦組織清除自由基的能力，減少過氧化產(chǎn)物對腦組織的損傷，進而降低腦老化的程度，發(fā)揮其抗衰老作用。

綜上所述，白藜蘆醇具有明顯的保護D-半乳糖所致小鼠衰老的作用，具有提高衰老小鼠的學習記憶能力，在抗衰老方面，有著可觀的發(fā)展和開發(fā)前景。

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Effects of Resveratrol on Learning, Memory and Brain Antioxidant Abilities in D-Galactose-Induced Aging Mice

LIU Gui-shan1,2, YANG Bo3, ZHANG Ze-sheng2,*, FAN Yan-li1, HE Wei2
(1. School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021, China; 2. College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 3. Xinhua College, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)

Objective: To investigate the effects of resveratrol (Res) on learning, memory and brain antioxidant capacities in D-galactose-induced aging mice. Methods: Fifty ICR mice were randomly divided into five groups, designated as normal control, model, resveratrol low-dose, moderate-dose and high-dose groups. The normal control group was given normal saline by gavage, and all other groups were given D-galactose solution by neck back subcutaneous injection at the daily dose of 120 mg/(kg·d) for 8 consecutive weeks. At the same time, Res-treated mice were administered Res by gavage at the daily doses of 25, 50 and 100 mg/(kg·d) body weight per day, respectively. The learning and memory abilities of mice were determined by Morris water maze test. Superoxide dismutase (SOD), total antioxidant capacity (T-AOC) and malondialdehyde (MDA) in the brain of mice were determined at the end of 12 h of fasting after the last administration. Results: Res could reduce the time mice spent on finding platform (P ＜ 0.01), improve the swimming speed (P ＜ 0.01) and the number of times mice crossed the platform (P ＜ 0.01) in Morris water maze test, increase SOD (P ＜ 0.01) and T-AOC activities (P ＜ 0.05) and decrease the content of MDA (P ＜ 0.01) in brain tissue. Conclusion: Res can ameliorate the degeneration of learning and memory abilities in D-galactose-induced aging mice, improve brain antioxidant abilities and thus delay brain aging.

resveratrol; D-galactose; learning and memory abilities; antioxidation

TS201.2

A

1002-6630（2014）05-0204-04

10.7506/spkx1002-6630-201405040

2013-04-07

2012年度寧夏大學科學研究基金項目（ZR1201）；高等學校博士學科點專項科研基金項目（20101208110001）

劉貴珊（1979—），男，講師，博士，研究方向為天然產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化及功能食品。E-mail：guishanliu2008@sina.com

*通信作者：張澤生（1956—），男，教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化及功能食品。E-mail：zhangzesheng@tust.edu.cn