吳玉江，富國文，益西多吉，王紹卿，張念偉，滕曉紅，索朗達，巴 貴，次仁德吉，樊月圓＊

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩850009；2.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，云南昆明650201）

西藏絨山羊是我國養(yǎng)殖歷史較為悠久的一種絨山羊，主要分布的克什米爾絨山羊屬國家重點保護品種之一，有高原型和山谷型之分，廣泛分布在西藏西北部廣袤的羌塘草原，其中阿里、那曲地區(qū)的白絨山羊是西藏絨山羊的典型代表［1］，其羊絨品質居世界羊絨之首［2］。羊毛纖維的品質直接影響了羊絨的價格，其中絨纖維細度是影響價格的最主要因素。除此之外長度、顏色、光澤度和拉力強度等也是衡量羊絨品質的重要指標。這些性狀是非遺傳因素和遺傳因素共同作用的結果，它不僅受基因水平上的影響，而且生理狀態(tài)、年齡、營養(yǎng)和氣候等對其也有影響［3，4］。角蛋白（Keration）和角蛋白關聯(lián)蛋白（keratin associated proteins，KAPs）是羊絨的主要結構蛋白，國內(nèi)外大量研究表明，羊絨的角蛋白組成與其纖維的品質有密切關系，并受遺傳、營養(yǎng)、生理和環(huán)境等因素的影響而發(fā)生變化［5－9］。KAPs是動物毛發(fā)的結構蛋白之一，根據(jù)其氨基的Cys含量，KAP蛋白被分為3類，分別為高硫家族（Cys＜30%）、超高硫家族（Cys＞30%）和富含Gly－Tyr家族［10－11］。目前大量研究表明，KAP基因的遺傳差異可能在決定不同毛品質和產(chǎn)量等性狀方面發(fā)揮重要的作用［12－17］。

本文采用PCR－SSCP 技術，以KAP6.3作為候選基因，對其多態(tài)性進行了分析，旨在探索KAP6.3基因多態(tài)性對西藏絨山羊生產(chǎn)性狀的影響，為闡明西藏絨山羊品種特點及選種選育提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集西藏自治區(qū)曲尼帕試驗站144只周歲西藏絨山羊耳組織樣本，公母各半，放入無水乙醇于－20℃保存?zhèn)溆谩．a(chǎn)絨前體重、體高、體長、胸圍、胸深、十字部高、絨長、毛長以及產(chǎn)絨量等數(shù)據(jù)，由曲尼帕試驗站提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 耳組織樣基因組DNA 提取 取15mg 左右耳組織，讓其表面酒精揮發(fā)后，用剪刀盡可能地將其剪成碎末，轉入1.5mL 離心管，參照DNA 提取試劑盒（TaKaRa）說明書進行提取。提取的基因組DNA 通過核酸蛋白分析儀測定其濃度，0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物信息 參照GenBank 提供的山羊KAP6.3基因序列（登錄號：AY310751）及劉海英（2007）［15設計的引物。上游引物為：5＇－GCTATGGAGGCCTGGGCTG－3＇，下 游 引 物 為：5＇－GGAAAATTGGAGGGTGAGAGTCTTC－3＇，預期擴增片段長度為199bp。引物由上海生物工程技術服務有限公司合成，其Tm 值為62.5 ℃。

1.2.3 PCR 擴增 PCR 反應體系：10×Premix taq 12.5μL，模板DNA 1μL（50ng／μL），上游引物0.5 μL（10pmol／μL），下游引物0.5μL（10pmol／μL），ddH2O10.5μL，共計25μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5min；30個循環(huán)（94℃30s，62.5℃40s，72℃1min）；72℃延伸10min，4℃保存。

1.2.4 PCR－SSCP分析與測序 用14%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，電泳前120V 預電泳30 min。4 μL PCR 產(chǎn)物和8μL的變性buffer（95%去離子甲酰胺、1 mmol EDTA （pH＝8.0）、0.025%二甲苯菁、0.025%溴酚藍、10%甘油），98 ℃變性10min，取出迅速置于準備好的碎冰中，使之保持單鏈狀態(tài)，10min后全部上到14%聚丙烯酰胺凝膠（Acr：Bis＝29：1）中電泳。200V 高壓電泳30min，然后110 V 電泳20h左右；電泳結束后，進行銀染顯帶并用紫外凝膠成像系統(tǒng)照相分型。選取不同基因型個體的DNA 樣品進行克隆，測序由上海生物工程技術有限公司進行。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

對不同基因型頻率進行統(tǒng)計。運用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，根據(jù)最小二乘線性模型，分析KAP6.3基因的性別因素和基因型因素的交互效應，采用了以下固定模型：Yijl＝μ＋αi＋βj＋eijl。式中：Yijl為個體表型記錄，μ為試驗全部觀測值總體平均值，αi為性別效應，βj為基因型效應，eijl為隨機誤差。

2 結果與分析

2.1 PCR 產(chǎn)物和PCR－SSCP檢測結果

PCR 擴增結果見圖1，擴增片段長度為199bp；用14%聚丙烯酰胺凝膠檢測其SNPs，其檢測結果共發(fā)現(xiàn)5種基因型，分別命名為基因型1、基因型2、基因型3、基因型4和基因型5，PCR－SSCP 電泳結果見圖2。

圖1 KAP6.3基因的PCR 擴增產(chǎn)物1－6為擴增產(chǎn)物；M.DL 1000Fig.1 Amplified products of KAP6.3gene.1－6were amplified products；M was DL1000

圖2 KAP6.3基因的PCR－SSCP檢測結果1－5為KPA6.3基因的5種基因型Fig.2 PCR－SSCP Test of KAP6.3gene1－5marked different genotypes of KAP6.3gene

2.2 KAP6.3基因擴增產(chǎn)物的序列分析

克隆測序結果與 GenBank （序列號：AY310751）中的序列進行對比，發(fā)現(xiàn)擴增片段內(nèi)存在7 個SNPs，分別位于C134T、G148A、G170A、T210C、A217G、A229C 和T284G 處，其中T284G存在于該基因的3＇－UTR 端。PCR－SSCP 和測序結果結合分析，分型如下：C－N－N－T－A－A－N 連鎖突變命名為基因型1；C－N－G－T－N－A－T 連鎖突變命名為基因型2；C－N－N－T－A－N－T連鎖突變命名為基因型3；N－N－N－T－A－A－T連鎖突變命名為基因型4；C－NN－N－A－A－T連鎖突變命名為基因型5。各基因型序列比較結果如下：

圖3 5種基因型的核甘酸序列與GenBank上的序列的BLAST結果Fig.3 BLAST result of nucleotide sequences of 5genotypes in GenBank

2.3 KAP6.3基因編碼區(qū)氨基酸變化

利用DNAman軟件對7個SNPs 造成的氨基酸變化進行分析，發(fā)現(xiàn)共存在2個同義突變和4個錯義突變，4處錯義突變分別為148位點TGC（Cys半胱氨酸）→TAC（Tyr酪氨酸）；210位點TCT（Ser絲氨酸）→CCT（Pro 脯氨酸）；217位點TAT（Tyr酪氨酸）→TGT（Cys 半胱氨酸）和229 位點TAT（Tyr酪氨酸）→TCT（Ser絲氨酸）。具體于各基因型中的分布如圖4，比較發(fā)現(xiàn)5種基因型都在第30位發(fā)生了氨基酸Cys→Tyr的錯義突變；基因型2的53位的氨基酸由Tyr轉變?yōu)镃ys；基因型3的57位的氨基酸由Tyr轉變?yōu)镾er；基因型5的51位的氨基酸由Ser轉變?yōu)镻ro。

圖4 5種基因型對應氨基酸序列的比對結果Fig.4 Comparison of amino acid sequence of 5genotypes

2.4 西藏絨山羊KAP6.3基因的基因型頻率

根據(jù)聚丙烯酰胺膠圖對應測序結果對所有試驗個體進行分型，統(tǒng)計各基因型頻率，結果如表1 所示。檢測到的5種基因型中，基因型2在群體中的頻率最高（50%），基因型1次之，這兩種基因型是群體的優(yōu)勢基因型，占群體頻率的89%；基因型3～5在群體中個體較少，其頻率在3%～6%范圍。

表1 西藏絨山羊KAP6.3 基因的基因型頻率分布Table 1 Genotypes frequency of KAP6.3gene in Tibetan Cashmere goats

2.5 西藏絨山羊KAP6.3基因多態(tài)性與生產(chǎn)性狀的相關性分析結果

考慮到基因型3、基因型4和基因型5在群體中所占比例不足10%，本研究只將基因型1和基因型2與生產(chǎn)性狀做了相關性分析。在由表2可見，從基因型考慮，在體重指標方面，周歲西藏絨山羊母羊的基因型1 個體顯著高于基因型2 個體（P＜0.05）；從性別因素考慮，在體尺性狀方面，母羊在體高指標方面顯著優(yōu)于公羊（P＜0.05），在十字部高指標方面極顯著優(yōu)于公羊（P＜0.01）；而在產(chǎn)絨性狀方面，公羊個體在毛長指標方面極顯著優(yōu)于母羊（P＜0.01），產(chǎn)絨量也顯著高于母羊（P＜0.05）；而基因型和性別的互作沒有對生產(chǎn)性狀產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）。

3 討論

3.1 KAP 家族基因多態(tài)性與產(chǎn)絨性狀的相關性

KAPs是編碼毛發(fā)纖維組成蛋白的一種結構基因，由多基因家族編碼。目前在綿羊和山羊上報道有KAP1、KAP6、KAP8、KAP9、KAP13基因與羊毛的質量和產(chǎn)量的相關性研究。劉桂芬等［12］對高硫蛋白基因（KAP1.1、KAP1.3）的多態(tài)位點W08667與羊毛細度的相關性進行研究，發(fā)現(xiàn)該位點對新疆優(yōu)質細毛羊的羊毛細度有顯著影響（P＜0.05）；Itenge－Mweza等［13］研究發(fā)現(xiàn)KAP1.1基因在美利奴綿羊中存在多態(tài)性，且與羊毛的細度有顯著的相關性；王杰等［14］利用PCR－SSCP方法對高原型藏山羊的KAP6.1和KAP6.2基因進行判型，并對各個基因型與產(chǎn)絨量、絨長度和細度的相關性進行分析；劉海英［15］在KAP6.3基因的編碼區(qū)和3＇－非翻譯區(qū)共發(fā)現(xiàn)了10個SNPs位點，其中AB 基因型產(chǎn)絨量顯著高于其它基因型；F 和H 基因型的產(chǎn)絨量最高，且絨長度最長；AC 基因型的絨纖維細度最小；KAP8.1和KAP8.2基因的多態(tài)性研究見于趙俊星等［16］和劉海英等［15］，共有4 個SNPs被發(fā)現(xiàn)；研究發(fā)現(xiàn)KAP13－1基因也存在豐富的多態(tài)性。綜上所述，KAP基因雖然具有較大的基因變異，但并未導致動物的致死，只是改變了毛發(fā)的特征如產(chǎn)絨量、絨的細度和長度等，因此這些變異才得以遺傳保留。這也使得在KAP基因家族尋找影響產(chǎn)絨性狀的有效QTL成為可能。

3.2 KAP6.3基因的多態(tài)性以及與生產(chǎn)性狀的關系

本次試驗采用PCR－SSCP技術及DNA 克隆測序方法對西藏絨山羊KAP6.3基因的編碼區(qū)和部分3＇－UTR區(qū)（199bp）進行多態(tài)性研究，顯示為5種基因型，經(jīng)測序共發(fā)現(xiàn)7個SNPs，與劉海英［15］在內(nèi)蒙古絨山羊上檢測到的SNPs有4 處相同，分別為C134T、G170A、A217G 和A229C，C149T 和G163A處的突變是在內(nèi)蒙古絨山羊上檢測得到，而G148A、T210C 和T284G 突變是在西藏絨山羊上檢測得到的。由此可見，KAP6.3基因保守性較差，從而具有豐富的遺傳變異，但由于研究群體所處的地理環(huán)境及氣候條件的影響，不同種群變異位置存在較大差異。同時對7個SNPs所導致的氨基酸的變化進行比對，共存著4處錯義突變，分別為30位Cys→Tyr、51位Ser→Pro、53位Tyr→Cys、57 位Tyr→Ser。其中217位和229位氨基酸變化與劉海英研究一致。氨基酸的改變可能會影響蛋白質的構型和表達，從而影響動物的經(jīng)濟性狀。因此本研究又將優(yōu)勢基因型1和基因型2對西藏絨山羊生產(chǎn)性狀的影響做了相關性分析。分析結果顯示，周歲母羊在體尺指標如體高、十字部高方面顯著高于公羊，而周歲公羊在毛長和產(chǎn)絨量方面明顯優(yōu)于母羊（P＜0.05）。同時也發(fā)現(xiàn)，其它體尺指標，如體重、體長、胸圍、胸深，母羊都高于公羊；而測定的三個產(chǎn)絨性狀指標－絨長，毛長，產(chǎn)絨量，公羊卻高于母羊。因此，分析產(chǎn)絨指標不僅跟動物皮膚面積的大小有關，而單位面積皮膚的絨密度可能才是決定產(chǎn)絨量的主要因素。

表2 基因型和性別對西藏絨山羊生產(chǎn)性狀的方差分析Table 2 ANOVA between genotypes and sex and production traits in Tibetan Cashmere Goats

4 結論

KAP6.3基因在西藏絨山羊群體中存在較大的遺傳變異，這些變異與羊的生產(chǎn)性狀指標密切相關，可將其作為影響西藏絨山羊生長性狀和產(chǎn)絨性狀的候選基因，用于其具高產(chǎn)品系選育的輔助分子標記。

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