葛 瑩，狄 冉，儲(chǔ)明星，劉秋月，胡文萍，王翔宇

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

在晝夜不斷更替的循環(huán)下，動(dòng)物的行為和生理方面都發(fā)生了顯著變化。這是由于動(dòng)物應(yīng)對(duì)環(huán)境變化（如食物供給、捕食風(fēng)險(xiǎn)、溫度以及光照等）長期選擇的結(jié)果。因此動(dòng)物天生具有計(jì)時(shí)機(jī)制，也就是晝夜節(jié)律鐘，它能驅(qū)使生理和行為發(fā)生晝夜節(jié)律性變化。根據(jù)環(huán)境信號(hào)特別是光照，晝夜節(jié)律鐘每日重置并且保證內(nèi)源節(jié)律24h與此同步。為了更好地理解晝夜節(jié)律生物鐘，相關(guān)學(xué)者探討了miRNA 在晝夜節(jié)律中的潛在影響。

1 miRNA 概述

近年來，研究者發(fā)現(xiàn)一類新的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子－microRNAs（miRNAs），作為小的單鏈RNA 分子，長度為22nt左右，由基因組非編碼區(qū)域轉(zhuǎn)錄而來［1－2］。這一過程是由RNA 聚合酶Ⅱ加工成的前體pri－miRNA，其具有5′端帽子結(jié)構(gòu)和3′端PloyA尾巴結(jié)構(gòu)，然后被剪切成約70nt具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA［1，3］。在細(xì)胞核中，pri－miRNA 在RNaseⅢ酶Drosha 以及其他輔助因子的作用下被加工［4－5］，從而產(chǎn)生具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體pre－miRNA。然后由依賴Ran的核轉(zhuǎn)運(yùn)受體家族成員轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5（Exp5）將pre－miRNA 從胞核運(yùn)到胞質(zhì)；到達(dá)胞質(zhì)后，pre－miRNA 在胞質(zhì)核酸酶RNaseⅢdicer參與下進(jìn)行第二次加工，pre－miRNA 被裂解成miRNA雙鏈，隨后它的一條鏈保留成為成熟的miRNA［6－8］，而另一條鏈有些被未知RNA 酶降解，有些也可以作為成熟miRNA。成熟的miRNA 與RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA－induced silencing complex，RISC）結(jié)合并形成miRNP，之后該復(fù)合物會(huì)結(jié)合到靶mRNA 上，抑制靶基因的表達(dá)，從而發(fā)揮作用［9－11］。miRNA 通過與靶基因的3′UTR 區(qū)堿基配對(duì)來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，大部分miRNA 通過與mRNA 結(jié)合降解mRNA 或者抑制翻譯過程，只有少數(shù)miRNA 可以增加靶基因的表達(dá)。

1993年，科學(xué)家首次在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)miRNA（lin－4及l(fā)et－7），并確定了它們?cè)诰€蟲發(fā)育中的時(shí)間調(diào)控作用［12］，隨后大量的miRNAs相關(guān)研究使得人們對(duì)miRNA 的功能機(jī)制理解得越來越清楚。在哺乳動(dòng)物中，約60%的編碼蛋白基因受到miRNA 的分子調(diào)控［13］，并且參與調(diào)節(jié)了多個(gè)生理活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖與分化、激素分泌、新陳代謝、肌肉和脂肪的形成發(fā)育、免疫應(yīng)答反應(yīng)、疾病的發(fā)生和腫瘤的形成等。

2 晝夜節(jié)律的分子機(jī)制

哺乳動(dòng)物的晝夜節(jié)律系統(tǒng)是由作用于中樞生物鐘和外周節(jié)律震蕩器組成的，其中中樞生物鐘定位于下丘腦中的視交叉上核（suprachiasmatic nuclei，SCN），而外周節(jié)律震蕩器則分布于外周各器官組織。中樞生物鐘自身與每日晝夜循環(huán)產(chǎn)生的外部信號(hào)同步，并且將信號(hào)傳遞給其他多個(gè)組織特異性的生物鐘［14］。作為晝夜節(jié)律的基礎(chǔ)，這種分子機(jī)制存在于每個(gè)細(xì)胞中，由自主轉(zhuǎn)錄反饋回路組成。調(diào)控節(jié)律震蕩的分子通路的核心轉(zhuǎn)錄元件是CLOCK／BMAL1（Brain and Muscle Arnt－Like 1）復(fù)合物［15－16］。由于啟動(dòng)子中存在E－box（鐘特異的序列）增強(qiáng)子元件，這種異源二聚體能夠作為轉(zhuǎn)錄因子來誘導(dǎo)節(jié)律輸出基因－鐘控基因（clock－controlled genes，CCGs）的表達(dá)［17］。下游的CCGs 也是CLOCK／BMAL1的負(fù)調(diào)控因子，包括Period基因家族（Per1、Per2 和Per3）、隱色素基因（Cry1 和Cry2）以及Rev－Erbα基因［16，18，19］。Rev－Erbα可與Bmal1 啟動(dòng)子結(jié)合，阻遏Bmal1 的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致CLOCK／BMAL1的活性受到抑制以及CCG 的表達(dá)量降低［20］。這一抑制模式引起B(yǎng)MAL1 mRNA表達(dá)水平的循環(huán)變化，而CCGs的表達(dá)水平在其反相位上循環(huán)變化。在細(xì)胞核內(nèi)，當(dāng)BMAL1、Per和Cry蛋白中的其他負(fù)調(diào)控因子表達(dá)量最高時(shí)，它們就能抑制E盒依賴型基因表達(dá)［18］。這樣，一旦分子生物鐘重置，就會(huì)開始一個(gè)新的循環(huán)。對(duì)于鐘基因的表達(dá)調(diào)控研究主要集中在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯后的修飾，但是轉(zhuǎn)錄后的變化過程也對(duì)這些基因起著重要的調(diào)控作用。Per蛋白的磷酸化和降解能夠調(diào)控哺乳動(dòng)物生物鐘的時(shí)間設(shè)置。另外，Bmal1和Cry蛋白經(jīng)過磷酸化、泛素化、SUMO 化以及乙?；饔每稍谵D(zhuǎn)錄后水平控制自身的活性。

目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)已經(jīng)鑒定出至少8種生物鐘相關(guān)的基因，包括Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock、Bmal1和Timless基因等。生理上的晝夜節(jié)律是由復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控產(chǎn)生的，這些基因的表達(dá)與多種因素有關(guān)，包括轉(zhuǎn)錄的調(diào)控節(jié)律性、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的時(shí)間依賴性以及翻譯和翻譯后調(diào)控的局限性。其中，嚴(yán)格的轉(zhuǎn)錄調(diào)控對(duì)校正節(jié)律循環(huán)的必要性已經(jīng)得到驗(yàn)證［21］，而且轉(zhuǎn)錄后調(diào)控對(duì)微調(diào)晝夜節(jié)律具有非常重要的影響［22］，因此miRNAs具有調(diào)控晝夜節(jié)律的能力［23］。

3 miRNA 對(duì)晝夜節(jié)律的調(diào)控

自從發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的分子機(jī)制以來，嚴(yán)格的轉(zhuǎn)錄調(diào)控就被認(rèn)為是校正晝夜循環(huán)必不可少的組成部分。最近，轉(zhuǎn)錄后元件也被認(rèn)為參與生物鐘調(diào)控。而miRNAs的作用類似于分子控制開關(guān)，并且能夠調(diào)控成百上千的基因表達(dá)。

通過TargetScan、PicTar以及microrna.org等生物信息學(xué)研究工具，能夠成功預(yù)測(cè)與晝夜節(jié)律相關(guān)的miRNAs。Figueredo等［24］預(yù)測(cè)了69個(gè)miRNAs與動(dòng)物晝夜節(jié)律相關(guān)，其中三分之一已有文獻(xiàn)報(bào)道，某些miRNAs通過與鐘基因的靶關(guān)系來調(diào)控晝夜節(jié)律。具有節(jié)律性表達(dá)的miRNAs不一定與動(dòng)物的晝夜節(jié)律相關(guān)，無節(jié)律性表達(dá)的miRNAs卻可能在晝夜節(jié)律中發(fā)揮著重要作用［25］。

3.1 miRNA 對(duì)中樞生物鐘機(jī)制的調(diào)控

在小鼠的視網(wǎng)膜和視交叉上核、果蠅的大腦以及擬南芥中，已發(fā)現(xiàn)一些miRNAs呈節(jié)律性表達(dá)。還有一些miRNAs直接參與生物鐘系統(tǒng)，能夠受光照誘導(dǎo)或調(diào)控節(jié)律周期。

Cheng等［26］研究發(fā)現(xiàn)，在SCN 中miR－132 和miR－219的表達(dá)具有節(jié)律性，而且都屬于CCGs。miR－219能夠調(diào)節(jié)小鼠的生理節(jié)律和縮短晝夜周期，而miR－132 是光復(fù)位時(shí)鐘的負(fù)調(diào)控因子。其中，miR－219可以縮短晝夜周期10～20min，但是這種miRNA 能夠改變晝夜周期的確切機(jī)制還有待驗(yàn)證。在這兩個(gè)miRNA 靶基因中沒有發(fā)現(xiàn)生物鐘的核心元件，表明這些miRNAs通過間接機(jī)制影響生物鐘。依賴cAMP 效應(yīng)元件和促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）機(jī)制，miR－132對(duì)光照進(jìn)行調(diào)控，并且能夠促進(jìn)光誘導(dǎo)相位延遲。相反，miR－219 由CLOCK／BMAL1驅(qū)動(dòng)，并且敲除內(nèi)源性miR－219導(dǎo)致節(jié)律周期變長。

除此之外，Nagel等［27］也發(fā)現(xiàn)一類miRNAs能夠調(diào)控生物鐘的核心元件。通過正向遺傳學(xué)篩選，他們發(fā)現(xiàn)miR－192／194族能夠抑制Per家族所有基因的表達(dá)，從而說明miR－192和miR－194是重要的晝夜節(jié)律調(diào)控因子。在NIH－3T3 細(xì)胞中，過表達(dá)miR－192／194能顯著縮短晝夜節(jié)律周期，可能是由于這些miRNAs抑制Per基因的表達(dá)引起的，基因敲除小鼠Per1、Per2和Per3導(dǎo)致晝夜周期分別縮短約1、1.5和0.5h。因此miR－192／194在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控核心鐘基因蛋白。推測(cè)miR－192／194 抑制部分Per基因的表達(dá)可能達(dá)到類似完全喪失整個(gè)Per基因?qū)円构?jié)律鐘的效果。同樣，Chen等［28］也證明了miRNA 介導(dǎo)的RNA 干擾在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控核心鐘基因，通過控制Per基因表達(dá)水平來調(diào)控晝夜節(jié)律。

果蠅是研究最廣泛最深入的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，它在晝夜節(jié)律研究進(jìn)展方面扮演著重要的角色。早在20世紀(jì)70年代，人們就對(duì)果蠅的晝夜節(jié)律進(jìn)行遺傳分析。Yang 等［29］發(fā)現(xiàn)在野生型果蠅的頭部，dme－miR－263a以及dme－miR－263b 有明顯的周期性，但在突變型中喪失表達(dá)的節(jié)律性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)miRNAs在持續(xù)黑暗中周期性表達(dá)。通過原位雜交分析這些在頭部特異性表達(dá)的miRNAs，結(jié)果顯示這些miRNAs在個(gè)別神經(jīng)元中表達(dá)水平變化較大，從而揭示miRNAs固有的表達(dá)可能是中等水平的變化，說明這些miRNAs對(duì)鐘基因表達(dá)具有精細(xì)調(diào)節(jié)的作用。此外，還預(yù)測(cè)某些鐘基因可能是晝夜節(jié)律的miRNA 的靶基因，如Per、clock、tim、dbt、cwo和tws。

Cry1基因也是分子鐘系統(tǒng)的核心基因。它的轉(zhuǎn)錄周期對(duì)維持鐘基因節(jié)律性表達(dá)至關(guān)重要，但是通過轉(zhuǎn)錄后和翻譯后的調(diào)控能夠微調(diào)節(jié)律周期。miR－185能夠與mCry1（mouse Cry1）的3′UTR 結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控mCry1 的表達(dá)。Lee等［30］發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)中的miR－185 水平和mCry1 蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，并且敲除miR－185 能夠提高mCry1蛋白水平變化的幅度。因此，miR－185控制mCry1mRNA 翻譯速率的節(jié)律性，從而對(duì)mCry1蛋白表達(dá)進(jìn)行微調(diào)控。

3.2 miRNA 對(duì)外周節(jié)律震蕩器的調(diào)控

3.2.1 miRNA 對(duì)肝臟中節(jié)律震蕩器的調(diào)控 在肝臟中，大多數(shù)代謝通路受晝夜節(jié)律調(diào)控，并且成百上千的蛋白編碼基因以循環(huán)的方式轉(zhuǎn)錄。Na等［25］通過Microarray表達(dá)譜分析研究了在48h內(nèi)每隔4h小鼠肝臟miRNA－mRNA 表達(dá)情況。其中晝夜節(jié)律的轉(zhuǎn)錄因子Clock和Bmal1與其對(duì)應(yīng)的miR－181d和miR－191表達(dá)方式呈負(fù)相關(guān)，而晝夜節(jié)律的抑制因子Per、Cry、CKIe和Rev－erba表達(dá)方式與其對(duì)應(yīng)的miRNAs表達(dá)方式呈正相關(guān)。該研究表明小鼠肝臟中miR－181d和miR－191能夠通過調(diào)節(jié)Clock和Bmal1復(fù)合物參與外周晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)。

miR－122在晝夜節(jié)律鐘中的作用很有趣，它與晝夜節(jié)律之間也有功能性相關(guān)，它是肝臟中特異性表達(dá)的miRNA。轉(zhuǎn)錄過程中miR－122在pre－miRNA 時(shí)呈節(jié)律性，成熟的miRNAs 卻保持穩(wěn)定。Nocturnin是晝夜節(jié)律下游的脫腺苷化酶（deadenylase），被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵因子，具有生物節(jié)律性，在RNA 水平具有明確的日節(jié)律變化，并且在夜間呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)［31］。miR－122 和脫腺苷酶Nocturnin之間具有靶關(guān)系，并且miR－122 對(duì)構(gòu)建Nocturnin晝夜節(jié)律表達(dá)譜具有重要的作用［32］。miR－122對(duì)Nocturnin表達(dá)的調(diào)控是聯(lián)系晝夜節(jié)律鐘和肝臟脂肪代謝的重要樞紐。

3.2.2 miRNA 對(duì)外周血液中節(jié)律震蕩器的調(diào)控

Shende 等［33］發(fā)現(xiàn)，miR－142－3p 特異性結(jié)合到Bmal1的3′UTR，并且過表達(dá)miR－142－3p 能夠引起SCN 細(xì)胞中BMAL1蛋白晝夜節(jié)律變化的模式發(fā)生改變。由于Bmal1在全身各組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)并且具有晝夜節(jié)律，因此miR－142－3p可能對(duì)外周生物鐘的核心元件具有類似轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用。與其它miRNA－靶基因相比，miR－142－3p 與Bmal1的關(guān)系很特殊，miRNA 抑制Bmal1的表達(dá)，但Bmal1卻能夠刺激miRNA 表達(dá)。另外，之前的研究表明miR－142－3p通過抑制T 細(xì)胞中的腺苷酸環(huán)化酶9（adenylate cyclase 9，ADCY9）的表達(dá)能夠調(diào)節(jié)cAMP 水平［34－35］，大鼠SCN 中cAMP 的表達(dá)在白天和夜晚都出現(xiàn)波峰并且cAMP 信號(hào)通路參與調(diào)控SCN 晝夜節(jié)律［36］。因此，miR－142－3p可能在SCN 的生理節(jié)律上起到重要作用。它不僅調(diào)控核心鐘基因Bmal1，也調(diào)控鐘控輸出元件cAMP，因此miR－142－3p通過重置或微調(diào)對(duì)生物鐘機(jī)制進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)。還發(fā)現(xiàn)同時(shí)過表達(dá)miR－142－3p和miR－494能降低內(nèi)源性Bmal1 水平，增加Per2 震蕩周期，并且培養(yǎng)基中細(xì)胞外的miR－143－3p／miR－494豐度升高；miRNA 表達(dá)量高的培養(yǎng)基能夠增加miR－142－3p在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，并且抑制原態(tài)細(xì)胞（nav?e cell）中Bmal1 3′UTR 活性；膜泡運(yùn)輸?shù)囊种埔蜃诱{(diào)控這些miRNAs 在細(xì)胞內(nèi)的交流以及Per2的總體節(jié)律性。因此miR－142－3p和miR－494可能像順式作用元件和反式作用元件那樣協(xié)調(diào)細(xì)胞自主晝夜節(jié)律鐘［37］。

目前只有少數(shù)研究報(bào)道m(xù)iRNAs與靜息－活動(dòng)節(jié)律有關(guān)［26，38］，并參與生物鐘功能或是輸入方式，而不是生物鐘輸出方式。Luo等［39］報(bào)道了miR－279的缺失不會(huì)影響中樞生物鐘，但是卻會(huì)破壞靜息－活動(dòng)節(jié)律，這說明該miRNA 是生物鐘輸出通路的調(diào)控元件。他們將miR－279 與節(jié)律相關(guān)的靶基因稱為unpaired（upd）－JAK／STAT 通路的配體，并且發(fā)現(xiàn)調(diào)控這一通路會(huì)破壞靜息－活動(dòng)節(jié)律。

3.2.3 miRNA 對(duì)視網(wǎng)膜中節(jié)律震蕩器的調(diào)控

為了研究斑馬魚中miRNAs可能對(duì)光輸送和生理節(jié)律的調(diào)控，研究人員已利用miR－seq篩選出在斑馬魚松果體中表達(dá)量高的光誘導(dǎo)的miR－NAs［40］，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)miR－183／96／182 在松果體中的表達(dá)量非常高并且被光照上調(diào)。之前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這個(gè)miRNA 族在小鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)水平呈日動(dòng)態(tài)變化，并且對(duì)晝夜節(jié)律的調(diào)控作用也得到了證實(shí)－通過與鐘控制基因ADCY6的靶向結(jié)合調(diào)控褪黑激素合成［41］。miR－183通過與光誘導(dǎo)的E4BP4－6 和鐘控芳烷基胺N－乙酰轉(zhuǎn)移酶2（Arylalkylamine－Nacetyltransferase 2，AANAT2）靶位點(diǎn)結(jié)合，從而下調(diào)mRNAs水平。此外，體內(nèi)敲除試驗(yàn)表明，miR－183有助于AANAT2mRNA 在松果體內(nèi)表達(dá)水平呈節(jié)律性［42］，隨后又發(fā)現(xiàn)小鼠視網(wǎng)膜中的miR－183／96／182受光調(diào)控并且靶向調(diào)控SLC1A1（興奮性氨基酸酸轉(zhuǎn)運(yùn)體3）［43］。

3.3 影響晝夜節(jié)律的miRNA 與疾病的關(guān)系

機(jī)體內(nèi)，除了神經(jīng)調(diào)節(jié)、體液調(diào)節(jié)以及免疫系統(tǒng)，晝夜節(jié)律是一個(gè)重要的調(diào)控系統(tǒng)，能維持生物體處于正常的生理水平。晝夜節(jié)律異?？赡苁辜?xì)胞功能下降，從而潛在地增加疾病發(fā)生的可能性，包括癌癥［44］。有研究表明哺乳動(dòng)物基因組中10%的基因受晝夜節(jié)律基因的調(diào)控［45］。在細(xì)胞中，因?yàn)榉肿隅姍C(jī)制調(diào)控與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及其它通路相關(guān)的基因表達(dá)，所以晝夜節(jié)律基因的畸變會(huì)導(dǎo)致生理過程的異常以及腫瘤的產(chǎn)生［46］。目前，miR－124作為腫瘤抑制因子被廣泛研究。它在膠質(zhì)瘤中常常被沉默，可能是miR－124－1啟動(dòng)子甲基化造成的［47］。Li等［48］研究發(fā)現(xiàn)人類惡性膠質(zhì)瘤和其細(xì)胞系中CLOCK表達(dá)水平顯著增加，而miR－124表達(dá)量下降。miR－124與CLOCK的3′UTR 靶向互補(bǔ)，miR－124受到抑制導(dǎo)致CLOCK基因的表達(dá)量增加。通過增強(qiáng)NF－ΚB的活性，CLOCK正調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖和遷移。

4 展望

近幾十年來，隨著研究者對(duì)miRNAs的廣泛研究，我們對(duì)其調(diào)控機(jī)制和功能有了更深入的理解，并且晝夜節(jié)律的轉(zhuǎn)錄－翻譯反饋模式和miRNAs對(duì)晝夜節(jié)律的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制已經(jīng)得到證實(shí)。核心生物鐘與分散的外周震蕩器共同協(xié)調(diào)動(dòng)物在晝夜之間生理和行為上的同步，但是它們之間相互作用的機(jī)制還不清楚。目前，該類研究還在不斷地進(jìn)行，未來將驗(yàn)證晝夜節(jié)律中的miRNAs的特異性靶基因和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為更加深入地闡明晝夜節(jié)律調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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