■王 燕 文奇男 許瑞雪 劉曉蘭 劉 驥 張永根 郭建華

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾，161006；2.遼寧省農(nóng)牧業(yè)機械研究所有限公司，遼寧沈陽 110036；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江哈爾濱，150030）

隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展，蛋白飼料緊缺的矛盾日益突顯。解決這一矛盾的主要途徑是開發(fā)新的飼料資源和合理利用現(xiàn)有的飼料資源。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)高蛋白飼料是解決目前飼料蛋白資源匱乏的有效途徑之一。我國淀粉主要來源于玉米，因此玉米蛋白粉的含量十分豐富，且蛋白含量高，基本都達到60%以上，但主要以醇溶蛋白為主，不易被吸收，適口性差，因此其應(yīng)用也受到了很大的限制。

好食性脈胞霉是本實驗室多年來致力研究的高產(chǎn)蛋白酶菌株，其對生長環(huán)境要求比較低。乳酸菌是生產(chǎn)發(fā)酵飼料常用的益生菌，能調(diào)節(jié)腸道正常菌群，拮抗外來菌的致病作用，促進飼料消化。許多研究表明，混菌發(fā)酵可顯著提高混菌體系各菌株的生長及代謝效率，并增加代謝產(chǎn)物的種類和產(chǎn)量。

龐錚采用好食性脈胞霉發(fā)酵玉米蛋白粉，使玉米蛋白粉的可溶性蛋白顯著提高。徐穎宣和徐桂轉(zhuǎn)將高產(chǎn)蛋白酶菌株與乳酸菌混合發(fā)酵飼料可有效改善腸道菌群，提高飼料的利用率。Hosoi等也將納豆芽孢桿菌與乳酸菌混菌發(fā)酵，結(jié)果表明納豆芽孢桿菌產(chǎn)生的過氧化氫酶和枯草蛋白酶促進乳酸桿菌的生長和活性，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸等代謝物顯著提高了發(fā)酵飼料的適口性。王德培等利用枯草芽孢桿菌和乳酸菌混菌發(fā)酵豆粕，提高了豆粕的適口性和飼料的利用率。

本課題以玉米蛋白粉和麩皮為生產(chǎn)原料，以好食性脈孢霉為主要菌種，嗜酸乳桿菌為輔助菌種，對玉米蛋白粉的發(fā)酵生產(chǎn)條件進行優(yōu)化，最大限度地提高玉米蛋白粉的蛋白溶解性，提高經(jīng)濟效益。

1 材料和方法

1.1 材料

好食性脈孢霉：齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實驗室保藏提供。

嗜酸乳桿菌：齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實驗室保藏提供。

土豆：市售。葡萄糖、無水乙醇、瓊脂、蛋白胨、酵母膏、氯化鈉均是分析純來自天津市科迷歐化學(xué)制劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化

1.2.1.1 好食性脈胞霉活化

將斜面保藏的菌種取一環(huán)接種到PDA固態(tài)培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，再取單菌落傳代培養(yǎng)，活化3～5代后備用。

1.2.1.2 嗜酸乳桿菌活化

將斜面保藏的菌種取一環(huán)接種到固態(tài)LB培養(yǎng)基中，在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，再取單菌落傳代培養(yǎng)，活化3～5代備用。

1.2.2 種子培養(yǎng)

1.2.2.1 好食性脈胞霉菌懸液的制備及種子生長曲線的確定

取干燥的錐形瓶，分成8組，每組3個重復(fù)，分別加入60 ml PDA培養(yǎng)基，滅菌后，在30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)。每隔4 h取出一組，先調(diào)pH值至3，后取10 ml于每個離心管中，離心10 min（6 000 r），棄除上清液后干燥離心管，管內(nèi)殘留質(zhì)量為菌體質(zhì)量，由此可計算菌體濃度。以時間為橫坐標，以菌體濃度為縱坐標繪制好食性脈孢霉種子培養(yǎng)生長曲線。

1.2.2.2 嗜酸乳桿菌菌懸液的制備及種子生長曲線的確定

取干燥的錐形瓶,分成11組,每組3個重復(fù),分別加入60 ml LB培養(yǎng)基，滅菌后，在30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)。前12 h，每隔2 h取出一組，之后便在18、22、36 h和48 h分別采用比色法測定菌體濃度，以時間為橫坐標，以菌體濃度為縱坐標繪制嗜酸乳桿菌種子培養(yǎng)生長曲線。1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)條件的優(yōu)化

根據(jù)可溶性蛋白的含量優(yōu)化以下的指標：混菌加菌順序及時間間隔、玉米蛋白粉和麩皮混合比例、培養(yǎng)基料水比、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間。在優(yōu)化培養(yǎng)基之前測出玉米蛋白粉原料的可溶性蛋白含量?？扇苄缘鞍椎臏y定方法參照福林酚法，具體方法略。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子生長曲線的確定

2.1.1 好食性脈孢霉種子生長曲線的確定（見圖1）

圖1 好食性脈孢霉種子生長曲線

由圖1可以看出，從0～8 h時菌體處于生長延滯期，這一時期是菌體適應(yīng)期，此時伴隨培養(yǎng)基吸水膨脹、子囊消失的過程。從8 h后，菌體便開始生長，一直到24 h時，菌體都處于對數(shù)生長期，菌體生長的穩(wěn)定期在24～28 h階段。菌體處于對數(shù)生長期時有較高的繁殖能力，同時又達到了較高的菌體濃度，是較為理想的種曲，所以選擇20 h為最佳的種子培養(yǎng)時間，此時的菌體濃度為3.65 mg/ml。本實驗室一直致力于好食性脈孢霉發(fā)酵玉米蛋白粉的研究，研究認為好食性脈孢霉最佳接菌量為0.12%(W/W)。

2.1.2 嗜酸乳桿菌的生長曲線（見圖2）

圖2 嗜酸乳桿菌種子生長曲線

由圖2可以看出，從0～4 h時菌體處于生長延滯期，這一時期是菌體適應(yīng)期，從4 h后，菌體便開始生長，一直到12 h時，菌體處于對數(shù)生長期，在12～48 h，嗜酸乳桿菌處于穩(wěn)定階段。對數(shù)生長期為最佳種子培養(yǎng)時間，所以選擇12 h為嗜酸乳桿菌最佳接菌時間。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 混菌加菌順序及時間間隔的確定

首先設(shè)11個組：①好食性脈孢霉和嗜酸乳桿菌同時加入；②只使用好食性脈孢霉發(fā)酵，培養(yǎng)4 d；③第1 d加入好食性脈孢霉，間隔24 h加入嗜酸乳桿菌，培養(yǎng)4 d；④第1 d加入好食性脈孢霉，間隔48 h加入嗜酸乳桿菌，培養(yǎng)4 d；⑤第1 d加入好食性脈孢霉，間隔72 h加入嗜酸乳桿菌，培養(yǎng)4 d；⑥只使用嗜酸乳桿菌發(fā)酵，培養(yǎng)4 d；⑦第1 d加入嗜酸乳桿菌，間隔12 h加入好食性脈孢霉，加入好食性脈孢霉后培養(yǎng)4 d；⑧第1 d加入嗜酸乳桿菌，間隔24 h加入好食性脈孢霉，加入好食性脈孢霉后培養(yǎng)4 d；⑨第1 d加入嗜酸乳桿菌，間隔36 h加入好食性脈孢霉，加入好食性脈孢霉后培養(yǎng)4 d；⑩第1 d加入嗜酸乳桿菌，間隔48 h加入好食性脈孢霉，加入好食性脈孢霉后培養(yǎng)4 d；○11第1 d加入嗜酸乳桿菌，間隔60 h加入好食性脈孢霉，培養(yǎng)4 d。

發(fā)酵培養(yǎng)基（7 g玉米蛋白粉、3 g麩皮、按料水比1∶1的比例加入10 ml蒸餾水）滅菌。pH值自然，培養(yǎng)溫度30℃，按以上10組設(shè)計培養(yǎng)后，按照福林酚法測定可溶性蛋白的含量。

圖3 好食性脈孢霉和嗜酸乳桿菌接菌順序及時間間隔的確定

根據(jù)圖3可以看出，先加入好食性脈孢霉，間隔48 h后加入嗜酸乳桿菌，所得的發(fā)酵飼料可溶性蛋白含量最高。所以，最適宜的混菌順序及間隔時間為先加入好食性脈孢霉，間隔48 h后加入嗜酸乳桿菌。

2.2.2 玉米蛋白粉和麩皮比例的確定

培養(yǎng)基的主輔料按以下5種比例混合（玉米蛋白粉∶麩皮分別為9∶1；8∶2；7∶3；6∶4；5∶5），按料水比1∶1的比例加入10 ml的蒸餾水，按0.12%（W/W）的接菌量加入好食性脈孢霉菌懸液，間隔48 h加入5×108cfu/ml的嗜酸乳桿菌菌懸液，pH自然，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)4 d。取各種比例的發(fā)酵底物按照福林酚法測定可溶性蛋白的含量（見表1）。

表1 輔料不同比例的培養(yǎng)基可溶性蛋白含量和增加量

根據(jù)表1可以看出，玉米蛋白粉與麩皮比例為7∶3時可溶性蛋白含量為3.93 mg/ml（P＜0.05），顯著高于其他比例，且可溶性蛋白的增加量最高（3.01 mg/ml），說明此時麩皮的營養(yǎng)成分可能更有利于促進菌體的生長，提高了菌體對底物的利用率，因此確定玉米蛋白粉與麩皮比例為7∶3時為最優(yōu)比例。

2.2.3 培養(yǎng)基料水比的確定

以7 g玉米蛋白粉和3 g麩皮為發(fā)酵底物，按0.12%（W/W）比例加入好食性脈孢霉，間隔48 h加入5×108cfu/ml嗜酸乳桿菌，pH自然，培養(yǎng)溫度為30 ℃，料水比設(shè)以下5個梯度：1∶0.5；1∶1；1∶1.5；1∶2；1∶2.5進行培養(yǎng)4 d。取各種料水比的發(fā)酵底物，根據(jù)福林酚法測定可溶性蛋白的含量（見表2）。

表2 不同料水比的培養(yǎng)基可溶性蛋白含量和增加量

根據(jù)表2，可以看出發(fā)酵培養(yǎng)基中料水比為1∶2時可溶性蛋白含量顯著高于其它比例（P＜0.05），為5.37 mg/ml。其次是料水比1∶2.5、1∶1.5和1∶1，最低的可溶性蛋白含量是1∶0.5?？扇苄缘鞍椎脑黾恿孔罡叩呐囵B(yǎng)基的料水比1∶2，其次是料水比1∶2.5；1∶1.5和1∶1，最低的是料水比是1∶0.5。因此混菌發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳料水比確定為1∶2。當料水比小于1∶2時，可能是伴隨著發(fā)酵的進行，培養(yǎng)基中由于水分蒸發(fā)而結(jié)塊，培養(yǎng)基中的水分不能滿足菌體生長需要，發(fā)酵到一定的時間后菌體就不再生長。而當料水比大于1∶2時，可能是由于培養(yǎng)基中的含水量大于好食性脈孢霉和乳酸菌的生長水分，從而導(dǎo)致此時可溶性蛋白含量偏低。

2.2.4 培養(yǎng)溫度的確定

以7 g玉米蛋白粉和3 g麩皮為發(fā)酵底物，按料水比1∶2的比例加入20 ml的蒸餾水，按0.12%（W/W）的接菌量加入好食性脈孢霉菌懸液，間隔48 h加入5×108cfu/ml嗜酸乳桿菌，pH自然，培養(yǎng)溫度設(shè)為以下5個梯度：27、30、33、36、39 ℃，培養(yǎng)4 d。取各種料水比的發(fā)酵底物，根據(jù)福林酚法測定可溶性蛋白的含量(見表3)。

表3 不同培養(yǎng)溫度可溶性蛋白含量和增加量

根據(jù)表3可以看出培養(yǎng)溫度為33℃時可溶性蛋白含量顯著高于其它培養(yǎng)溫度(P＜0.05)，為6.72 mg/ml,說明此時菌體生長最旺盛，產(chǎn)蛋白酶量最高，水解程度也最強，且此溫度下發(fā)酵飼料的可溶性蛋白的增加量也最多，為5.80 mg/ml。

2.2.5 培養(yǎng)時間的優(yōu)化

以7 g玉米蛋白粉和3 g麩皮為發(fā)酵底物，按料水比1∶2的比例加入20 ml的蒸餾水，按0.12%（W/W）的接菌量加入好食性脈孢霉菌懸液，間隔48 h加入5×108cfu/ml嗜酸乳桿菌，pH值自然，培養(yǎng)溫度為33℃，培養(yǎng)84 h。間隔12 h取發(fā)酵底物，根據(jù)福林酚法測出可溶性蛋白含量（見圖4）。

圖4 培養(yǎng)時間優(yōu)化

根據(jù)圖4，培養(yǎng)時間為72 h時，可溶性蛋白含量最高，為8.69 mg/ml。0～12 h可溶性蛋白含量較低且基本保持平穩(wěn)，12 h后緩慢上升直至48 h，48 h的可溶性蛋白含量達到7 mg/ml，48～60 h后可溶性蛋白含量下降，60 h后可溶性蛋白含量達到最大值8.69 mg/ml，之后又略有降低。綜上所述，培養(yǎng)時間為72 h時為最適宜發(fā)酵培養(yǎng)時間。

3 討論

發(fā)酵前期由于菌體處于開始生長階段，對底物的利用不充分，所以，可溶性蛋白含量較低。在48 h后，可溶性蛋白含量開始下降，可能是由于此時加入了嗜酸乳桿菌，嗜酸乳桿菌發(fā)酵后產(chǎn)生大量的酸，一定程度上抑制了好食性脈孢霉的生長。60 h后，由于兩菌之間存在共生作用，能夠克服中間產(chǎn)物過大對發(fā)酵產(chǎn)物造成的不利的影響，從而使可溶性蛋白含量開始繼續(xù)上升，在72 h時達到最高，而72 h后又開始下降，此時可能是由于發(fā)酵培養(yǎng)基中水分的散失或者是發(fā)酵底物的消耗或產(chǎn)物的積累等因素不利于菌體的生長。

培養(yǎng)基的含水量適宜是保證菌體順利生長的一個基本條件。研究表明，含水量偏低，菌體得不到充分的水分，菌絲易萎縮且孢子成熟遲緩，直接影響到發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量；含水量過高，則影響培養(yǎng)基的通透性，使菌體供氧不足，菌體生長受到抑制，還很容易染上其他霉菌。本試驗得出的結(jié)論是當料水比為1∶2時，可溶性蛋白提高的最多。當料水比為1∶2時，菌體生長旺盛，既能夠保證培養(yǎng)基的通透性，同時又滿足菌體生長的需要。玉米蛋白粉遇水黏結(jié)成團，會降低培養(yǎng)基的透氣性能，使活菌數(shù)和芽孢數(shù)減少，從而限制微生物生長，導(dǎo)致代謝物活力降低。在玉米蛋白粉加入麩皮可以使物料更加蓬松，有利于氧氣流通及熱量的消除，從而有利于好食性脈孢霉的生長，因此隨著麩皮比例的增加發(fā)酵培養(yǎng)基的可溶性蛋白含量增加。

培養(yǎng)溫度對發(fā)酵效果影響很大，大量研究表明，好食性脈孢霉單獨發(fā)酵飼料時最適溫度為25℃，嗜酸乳桿菌單獨發(fā)酵飼料時最適溫度為36℃，而混菌發(fā)酵時應(yīng)在以兩個溫度為界限的范圍內(nèi)，33℃符合理論要求，所以確定培養(yǎng)溫度為33℃時為最適溫度。

4 結(jié)論

本研究優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基為先加入好食性脈孢霉，間隔48 h加入嗜酸乳桿菌，玉米蛋白粉∶麩皮=7∶3,料水比=1∶2，pH值自然,培養(yǎng)溫度為33 ℃,培養(yǎng)72 h，此時發(fā)酵浸提液中可溶性蛋白含量8.69 mg/ml，而原發(fā)酵底物的浸提液中的可溶性蛋白含量為0.92 mg/ml，顯著地提高了飼料中的可溶性蛋白含量。

（參考文獻15篇，刊略，需者可函索）