■ 邢思華 華雪銘朱站英， 黃 衛(wèi) 沈彥萍沈文婧

(1.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201306；2.泗洪縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站泗洪縣水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇宿遷223900；3.杭州?；曙暳祥_(kāi)發(fā)有限公司，浙江杭州311100；4.上海沈李科工貿(mào)有限公司，上海200436)

作為國(guó)際公認(rèn)的綠色天然酶制劑[1-2]，溶菌酶具有無(wú)毒[3]、無(wú)害、專(zhuān)一性強(qiáng)[4]的特點(diǎn)，并已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)療[5]、食品[6]等行業(yè)。相關(guān)研究表明，溶菌酶在飼料行業(yè)也有著廣闊的應(yīng)用前景，在部分水產(chǎn)動(dòng)物飼料中使用[7-8]已取得良好的效果。然而針對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)生理特性[9-12]，漁用飼料高溫高壓的加工工藝特點(diǎn)以及酶制劑易失活的特性[13-14]，飼用溶菌酶在水產(chǎn)飼料中的可行性、穩(wěn)定性和真實(shí)有效性還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。研究采用人工模擬環(huán)境因子的方法探討溶菌酶酶活力受溫度、pH值等因素的影響，評(píng)價(jià)溶菌酶制品的儲(chǔ)存效果，并通過(guò)體外消解法探討溶菌酶制品對(duì)魚(yú)體內(nèi)源性消化酶的耐受性，為溶菌酶制品的改良及其在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

溶菌酶制品為粉狀脂質(zhì)體，采用薄膜法制備而成。

1.1 溶菌酶制品活性隨儲(chǔ)存時(shí)間、溫度和pH值的變化

將溶菌酶制品分裝在自封袋中，放入干燥器，室溫14～26℃保存。保存至60 d和90 d時(shí)在pH值7.2、37℃條件下分別測(cè)定溶菌酶活力。

以?xún)?chǔ)存至60 d的溶菌酶制品為試驗(yàn)材料，在37℃及不同pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0與8.0[15]）條件下測(cè)定溶菌酶活力。將溶壁微球菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h，用上述不同pH值的PBS沖洗菌落[16]，轉(zhuǎn)移至離心管，3 000 r/min離心1 min，棄上清液后，再用相應(yīng)的PBS重新混勻溶壁微球菌，使懸濁液的透光度在0.4左右；同時(shí)用相應(yīng)pH值的PBS溶解溶菌酶制品(0.01 g/ml)。

以保存至90 d的溶菌酶制品為試驗(yàn)材料，在pH值7.2及不同溫度條件下測(cè)定溶菌酶活力。使用恒溫水浴鍋將溫度分別控制在14、20、30、40、50、60、70、80、90℃和99℃。用pH值7.2的 PBS溶解溶菌酶制品(0.01 g/ml)、制備透光度約0.4的溶壁微球菌懸濁液。

溶菌酶活力測(cè)定：溶菌酶制品溶液50 μl和溶壁微球菌菌液3 ml在冰水浴條件下混勻，于570 nm處測(cè)量透光度，然后在試驗(yàn)設(shè)定溫度條件下水浴30 min，混勻冰水浴20 min以終止反應(yīng)，570 nm處測(cè)量透光度。溶菌酶活力計(jì)算公式如下：

1.2 含溶菌酶制品的飼料耐擠壓和耐高溫特性

將溶菌酶制品按300 mg/kg的添加量與基礎(chǔ)飼料原料（魚(yú)粉6.2%、豆粕23.4%、菜籽粕18.9%、小麥麩15.0%、次粉15.0%、米糠5.0%、面粉11.7%、磷酸二氫鈣1.5%、氯化膽堿1.0%、大豆油1.0%、復(fù)合多維0.5%、復(fù)合礦物質(zhì)0.5%、食鹽0.3%）逐級(jí)混合后加10%蒸餾水，取一部分經(jīng)絞肉機(jī)兩次擠壓，測(cè)定擠壓前后的溶菌酶活力；另取一部分密閉在自封袋內(nèi)，放入烘箱，80℃加熱2 h，待冷卻后破碎，過(guò)60目篩絹，用無(wú)菌的pH值7.2 PBS溶解，靜置20 min，反復(fù)混勻，3 000 r/min離心10 min后，取上清液在37℃條件下測(cè)定溶菌酶活力[17]。

1.3 體外消化試驗(yàn)

取草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）、鯽魚(yú)（Caras?sius auratus）和鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）的肝胰臟和腸道不同部位（去腸道內(nèi)容物），用pH值7.2的PBS漂洗后，吸干水分，裝入1.5 ml離心管待用。

用pH值7.2的PBS將肝胰臟和腸道勻漿后(質(zhì)量體積比1∶10)，3 000 r/min離心1 min，取上清液即為粗酶液；將粗酶液稀釋100倍后與儲(chǔ)存60 d的溶菌酶制品的PBS溶液(0.01 g/ml)37℃預(yù)熱后按體積比1∶9混合，混勻反應(yīng)30 min，測(cè)定溶菌酶制品與粗消化酶液反應(yīng)前后的溶菌酶活力。

試驗(yàn)魚(yú)規(guī)格：草魚(yú)(0.021 kg/尾)、鯉魚(yú)(0.52 kg/尾)、異育銀鯽(0.15 kg/尾)。溶菌酶測(cè)定方法參照1.1。

1.4 含溶菌酶制品的儲(chǔ)存試驗(yàn)

在基礎(chǔ)飼料原料(同1.2)中分別添加100、200、300、400 mg/kg與500 mg/kg溶菌酶制品(分別稱(chēng)為100、200、300、400、500飼料組)，用實(shí)驗(yàn)室小型制粒機(jī)加工成直徑為1.5 mm的顆粒飼料，密閉、干燥、常溫(14～30℃)保存，參考沈明泉等的方法[18]每隔30 d在37℃條件下測(cè)定溶菌酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶菌酶制品活性在不同溫度和pH值條件下的變化（見(jiàn)圖1～圖2）

圖1 溶菌酶制品酶活力隨溫度變化

圖2 溶菌酶制品酶活力隨pH值變化

從圖1可以看出，該溶菌酶制品的溶菌酶活力隨溫度升高呈現(xiàn)先升高后降低的顯著變化（P＜0.05），峰值出現(xiàn)在70℃。常溫與高溫條件下的溶菌酶活力無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明該溶菌酶制品對(duì)高溫具有比較強(qiáng)的耐受能力，可以承受飼料加工過(guò)程中的調(diào)質(zhì)處理。程建軍等[14]研究表明，未包被的蛋殼溶菌酶最適溫度在50℃左右，在50℃時(shí)抑菌效果最佳，而本試驗(yàn)結(jié)果顯示，該溶菌酶的最適溫度在70℃附近，說(shuō)明包被處理能在一定程度上提高溶菌酶的耐高溫性能。而在不同的pH值(3.0～8.0)條件下，溶菌酶活力變化不顯著(見(jiàn)圖2)，說(shuō)明該溶菌酶制品在理論上可以適應(yīng)不同水產(chǎn)動(dòng)物、不同消化道pH值的變化。這與賴(lài)曉芳等[19]的研究結(jié)果基本一致。

2.2 含溶菌酶制品的飼料耐擠壓和耐高溫特性(見(jiàn)表1)

表1 飼料加工環(huán)境模擬對(duì)飼料溶菌酶活力的影響

含溶菌酶飼料經(jīng)擠壓和高溫處理，溶菌酶活性從處理前的(0.64±0.01)×106U/g變化到(0.62±0.02)×106U/g和(0.55±0.01)×106U/g，但處理前后無(wú)顯著差異(P＞0.05)，說(shuō)明該溶菌酶制品對(duì)飼料加工過(guò)程有較好的耐受性。

2.3 消化酶對(duì)溶菌酶制品的體外消化（見(jiàn)圖3）

圖3 三種魚(yú)類(lèi)腸道和肝胰臟粗酶液對(duì)溶菌酶制品酶活力的影響

飼料中所添加的外源溶菌酶在水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)能否最大程度耐受內(nèi)源消化酶的消化分解，保持其自身的酶活性，是提高外源溶菌酶使用效果的重要影響因素[15]。從圖3可以看出，魚(yú)類(lèi)消化道所分泌的消化酶對(duì)溶菌酶制品活力的影響因魚(yú)的種類(lèi)以及消化道位置的不同而不同，總體而言，外源溶菌酶在魚(yú)類(lèi)消化道中被不同程度地消化，且在中腸處溶菌酶的酶活損失較大，這可能與不同魚(yú)類(lèi)的食性及消化道不同部位的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。鑒于溶菌酶對(duì)魚(yú)類(lèi)消化酶相對(duì)有限的耐受性，改進(jìn)溶菌酶制品的包被技術(shù)對(duì)提高外源溶菌酶的使用效果具有重要意義。

2.4 含溶菌酶制品飼料與溶菌酶制品的儲(chǔ)存試驗(yàn)

在0～90 d的保存期內(nèi)，單獨(dú)存放的溶菌酶制品酶活力顯著降低(P＜0.05，見(jiàn)圖4)。當(dāng)溶菌酶制品添加在配合飼料中時(shí)（見(jiàn)表2），隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，飼料中的溶菌酶活力逐漸降低。100 mg/kg組酶活變化出現(xiàn)一個(gè)折線(xiàn)趨勢(shì)，即0～30 d有較大的酶活變化，30～60 d出現(xiàn)一個(gè)穩(wěn)定時(shí)期，60～90 d后又出現(xiàn)一個(gè)酶活下降時(shí)期。200、300和400 mg/kg組的酶活在30 d以后保持相對(duì)穩(wěn)定。

圖4 溶菌酶制品酶活力隨儲(chǔ)存時(shí)間變化

表2 飼料中溶菌酶活力隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化（×106U/g）

相比較而言，溶菌酶制品單獨(dú)存放較添加到飼料中更容易造成溶菌酶活力的降低。其可能原因是單獨(dú)存放的溶菌酶制品需要應(yīng)對(duì)環(huán)境的作用，而添加在飼料中的溶菌酶制品被飼料原料中的蛋白、脂肪等包裹，形成的“保護(hù)層”使溶菌酶制品與空氣接觸的機(jī)會(huì)大大減少[18]，因此其活力變化比單獨(dú)存放時(shí)相對(duì)穩(wěn)定。另外，飼料中的溶菌酶活性雖然隨儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)有不同程度的降低，但水產(chǎn)養(yǎng)殖季節(jié)性明顯，飼料保存周期相對(duì)較短，因此，該溶菌酶制品符合漁用飼料的儲(chǔ)存要求，具有較大的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

本研究所用漁用溶菌酶制品具有耐高溫、耐擠壓、對(duì)酸堿度不敏感等特點(diǎn)；添加溶菌酶制品的飼料在3個(gè)月后仍能保持35%～45%的溶菌酶活性。鑒于溶菌酶制品在魚(yú)類(lèi)消化酶作用下會(huì)被部分分解，有必要對(duì)溶菌酶制品的包被技術(shù)進(jìn)行研究。