丑武江，王世銀，楊力偉，張兆旺，張莉君，張 偉＊

（1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，新疆昌吉831100；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，甘肅蘭州730070；3.新疆烏魯木齊榮盛養(yǎng)殖場，新疆烏魯木齊830000）

隨著家畜人工授精技術(shù)優(yōu)勢的日益顯現(xiàn)，豬精液的保存越來越受到人們的重視。國內(nèi)對豬精液常溫保存稀釋液配方的研究主要集中在兩個方面，一是對稀釋液基礎(chǔ)配方的篩選，在常規(guī)葡萄糖和檸檬酸鈉液的基礎(chǔ)上，參考國外進口稀釋液的配方組成，通過調(diào)整滲透壓、pH 或緩沖指數(shù)等篩選豬精液常溫保存稀釋液的基礎(chǔ)配方［1－5］。耿果霞等［2］研究表明，pH 為6.4 和6.5 的弱酸環(huán)境有利于豬精子的常溫保存；黃建國［3］研究表明，滲透壓為226mmol／L～387mmol／L（冰點下降值為0.42～0.72）時精液保存效果較好。二是研究在基礎(chǔ)液中添加安鈉加、咖啡因、維生素E、半胱氨酸以及不同的抗生素、中草藥等對豬精液常溫保存效果的影響［5－11］。羅義梅［6］發(fā)現(xiàn)，豬精液稀釋液中添加0.5%～1%的安鈉咖可有效延長精子的受精能力；張能適等［7］研究認為在每100mL稀釋液中加入5～10mg的苯甲酸鈉咖啡因也取得了較好的保存效果，張兆旺等［11］用中草藥的水劑保存豬精液，發(fā)現(xiàn)可有效緩解精子的衰老，延長精子存活時間。

眾多研究對豬精液的常溫保存提供了可靠的理論依據(jù)，但缺乏系統(tǒng)的液體參數(shù)控制方法，只對某一個稀釋液參數(shù)進行篩選，存在很大的盲目性，且大大增加了后期篩選試驗的工作量。

鑒于此，本研究首先確立了對稀釋液重要參數(shù)－滲透壓、pH 和緩沖指數(shù)的理論控制方法，在確定其準確性的基礎(chǔ)上，借鑒前人研究成果及本實驗室的前期研究數(shù)據(jù)，設(shè)計9 個稀釋液配方，并以進口BTS液為參照，篩選出最佳稀釋液配方，旨在開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的稀釋液配方用于生產(chǎn)實踐，降低豬人工授精的成本，同時也為其它家畜、家禽稀釋液的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗用精液采自烏魯木齊榮盛養(yǎng)殖場2頭杜洛克公豬，年齡分別為2.5歲和3歲。輸精母豬為該場大×長二元母豬，共計120頭，胎次在3～5胎之間。試驗動物按常規(guī)進行飼養(yǎng)和管理。

1.2 主要試劑及儀器

配制稀釋液的試劑均為國產(chǎn)分析純，電子天平（Sartorius公司）、滲透壓儀（Advanced公司）、酸度計（成都漢維斯科技有限公司）、精子質(zhì)量評定系統(tǒng)（北京中西遠大科技有限公司）、生物顯微鏡（Motic）、17 ℃恒溫箱（50L，青島海爾集團）、超純水系統(tǒng)（ABBOTA 公司）。

1.3 稀釋液配方設(shè)計

1.3.1 精液稀釋液pH 控制 根據(jù)“酸抑制”原理，弱酸性對精子的活動有抑制作用，有利于精液的保存，所以精液液態(tài)保存稀釋液的pH 應該偏酸性［12］。按照沖液pH 計算公式，對其進行控制。

式中：Pka為電離常數(shù)，Ca和Cs分別為弱酸及其弱酸鹽的濃度，Ca／Cs又稱緩沖比。將期望得到的pH 代入上式，可以得到所需pH 時需要加入的弱酸和弱酸鹽的濃度。按文獻［12］所示，結(jié)合本實驗室的研究數(shù)據(jù)，豬精液常溫保存稀釋液的pH 控制在6.0～6.5之間。

1.3.2 精液稀釋液滲透壓控制 精液液態(tài)保存稀釋液滲透壓按公式（2）進行控制：

式中：m（g）為每配制100mL 稀釋液需要加入試劑的質(zhì)量，A（mmol／L）為滲透壓，M 為相應試劑的分子量。n為該試劑溶于水后解離成的離子數(shù)，例如葡萄糖溶于水不解離，則n為1；KCl溶于水后解離成K＋和Cl－，則n為2。將期望得到的滲透壓值A(chǔ) 代入上式，得到要加入相應試劑的質(zhì)量m。

1.3.3 精液稀釋液緩沖能力的控制 按照以上精液稀釋液重要指標控制原理，參照前人研究成果及本實驗室前期數(shù)據(jù)，設(shè)計9個稀釋液配方（見表1）。

1～4號液主要是通過調(diào)整葡萄糖的量控制稀釋液的滲透壓，并通過計算理論值與實際測量值的誤差確定上述滲透壓控制的準確性，然后通過精液保存試驗確定合適的滲透壓水平。5～9號液則以此滲透壓值為標準，通過調(diào)整稀釋液成分改變其pH、緩沖能力及離子強度，并以進口BTS 液為參照，通過精液保存試驗篩選最佳配方用于豬精液常溫保存。

表1 豬精液常溫保存稀釋液成分Table 1 Swine semen extender ingredient and dose

1.4 精液采集、處理及保存

手握法采集公豬精液，四層紗布濾除膠狀物，置于保溫桶中迅速帶回實驗室。氣味、色澤正常，活力在0.8以上的精液分別用上述9中稀釋液按照1∶2 的比例稀釋，分裝到青霉素小瓶中，外面包上五層紗布后置于17 ℃恒溫箱中保存。每隔6 h，將稀釋精液輕輕震蕩混勻，以防精子沉淀堆積死亡。

1.5 精液保存效果評定

每12h進行一次精液品質(zhì)評定。精子活力為直線運動的精子占視野中總精子數(shù)的百分率，按照10級評分制進行評定；精子有效存活時間是指精子活力在0.5以上的保存時間；精子生存指數(shù)指相鄰兩次精子活率均數(shù)與間隔時間乘積的總和，其計算公式參照文獻［11］所示。

1.6 母豬輸精試驗

通過與進口BTS稀釋液的對比試驗，將上述稀釋液中最優(yōu)的稀釋液按照1∶2的稀釋比例稀釋豬精液，在17℃恒溫箱中保存5d，精子活力在0.5以上的稀釋精液用于人工授精試驗，通過情期受胎率和產(chǎn)仔數(shù)最終衡量其精液保存效果。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗均重復3 次，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件用方差分析進行差異顯著性分析，結(jié)果用“平均值±標準差”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋液pH、滲透壓和緩沖指數(shù)控制準確性

由表2知，用上述方法控制精液稀釋液的pH、滲透壓和緩沖指數(shù)切實可行，三者的準確性分別達到97.1%～99.42%、98.7%～99.68%和98.48%～99.16%，完全可以滿足稀釋液配方的設(shè)計。

2.2 不同滲透壓對豬精液常溫保存的影響

由表3可以看出，當滲透壓為345mmol／L 時，精液的有效保存時間為116.8h，生存指數(shù)26.12，均極顯著地高于滲透壓為336mmol／L、352mmol／L和370mmol／L（P＜0.01）。因此，5～9號液設(shè)計時滲透壓均控制為345mmol／L。

表2 9種稀釋液配方pH、滲透壓、緩沖指數(shù)理論值與實測值比較Table 2 The comparison of pH，osmotic pressure，buffer index of theoretical value and measured value

表3 不同滲透壓對豬精液常溫保存的影響Table 3 The effect of different osmotic pressure on swine semen preservation

2.3 最佳稀釋液配方的篩選

以345mmol／L為標準控制滲透壓，通過改變配方組分設(shè)計5－9號稀釋液，以進口BTS液為參照，通過精液保存試驗篩選最佳配方用于后續(xù)的常溫保存及輸精試驗（見表4）。

由表4可知，9號液有效保存時間極顯著高于5、6、7和8號液（P＜0.01），生存指數(shù)顯著高于8號液（P＜0.05），極顯著高于5、6 和7 號液（P＜0.01）。與進口BTS液相比，雖然BTS液的保存時間略長，但二者差異不顯著（P＞0.05）?？梢?，本試驗篩選的9號稀釋液的精液保存效果已達到進口同類稀釋液水平，可以用于豬人工授精試驗，以最終評價該稀釋液的優(yōu)劣。

表4 不同稀釋液對豬精液常溫保存的影響Table 4 The effect of different extender on swine semen preservation

2.4 9號稀釋液液常溫保存豬精液對母豬情期受胎率和產(chǎn)仔數(shù)的影響

以進口BTS液為對照，用9號稀釋液稀釋豬精液，在17℃恒溫箱中保存5d，精子活力在0.5以上的稀釋精液用于人工授精試驗。共輸精母豬120頭，具體結(jié)果見表5。

可見，和進口BTS 液相比，9 號稀釋液常溫保存5d的豬精液情期受胎率、平均窩產(chǎn)仔數(shù)雖然略低，但二者差異不顯著（P＞0.05），可以作為其替代產(chǎn)品用于我國豬人工授精。

表5 9號稀釋液常溫保存精液配種成績Table 5 The atificial insemination result of preservation semen extended by the 9th extender

3 討論

3.1 豬精液常溫保存稀釋液主要溶液參數(shù)的控制

豬精液保存在17℃時，精子仍處于活動狀態(tài)，只是強度有所下降。稀釋液的pH、滲透壓和緩沖指數(shù)對精子活力的維持具有重要影響，在稀釋液配方設(shè)計時應予以重點考慮。這三個參數(shù)可以通過調(diào)整稀釋液各個組分的相對量而調(diào)整，但需要設(shè)計大量配方，然后通過精液保存試驗進行篩選，存在很大的盲目性，后期篩選試驗工作量很大。本試驗中，在配方設(shè)計前先通過計算對上述三個指標進行理論控制，很大程度上避免了這種盲目性，大大提高了配方篩選的效率。通過理論計算及實際測量，pH、滲透壓和緩沖指數(shù)控制的準確度分別達到97.1%～99.42%、98.7%～99.68%和98.48%～99.16%，可以滿足精液稀釋液配方設(shè)計的要求。

3.2 不同pH 對豬精液常溫保存效果的影響

酸性環(huán)境對精子活動有抑制作用，相反堿性環(huán)境對精子活動有刺激作用，精子可以在附睪內(nèi)存活30～60d，與附睪內(nèi)的pH 為弱酸性（6.2～6.8）有密切的關(guān)系［12］。何蘭花等［8］對稀釋液pH 為6.4、6.6、6.8和7.0時豬精液常溫保存效果進行比較，結(jié)果表明pH 為6.4時保存效果最好［8］，這與耿果霞等［2］的研究結(jié)果一致。本試驗中，保存效果和受胎率最高的9號液，pH 實測值為6.28，也證明偏酸性的pH 環(huán)境有利于精子活力的保存。但是由于豬精液常溫保存過程中，精子代謝產(chǎn)生的CO2會使稀釋液的pH 進一步降低，如果超過精子的耐受能力必然會影響精子的存活，所以稀釋液自身的pH 不能過于偏酸性。

3.3 不同滲透壓對豬精液常溫保存效果的影響

精子之所以能夠在附睪中存活較長的時間，除了與其中弱酸性的環(huán)境有關(guān)以外，另一個重要因素就是附睪中的滲透壓。附睪中的滲透壓偏高滲（400 mOsm），使精子發(fā)生脫水現(xiàn)象，導致精子缺乏活動所需要的最低限度水分，故不能運動［12］。黃建國［4］研究了5 個滲透壓水平（冰點下降值△t為0.32、0.42、0.52、0.62、0.72和0.82，換算成毫滲透摩爾值分別為183、225、280、333、387和441mmol／L）對豬精液常溫保存效果的影響，表明當滲透壓為333 mmol／L 時，精液有效保存時間和受胎率均最高。本試驗中，最適宜滲透壓為345 mmol／L，與黃建國［4］的研究結(jié)果基本一致。但蔡元等［5］在對比不同進口稀釋液精液保存效果后發(fā)現(xiàn)，滲透壓為230 mmol／L的BTS液保存效果最好，這與本試驗及黃建國［4］的研究結(jié)果差距較大。

3.4 緩沖指數(shù)對豬精液常溫保存效果的影響

精子在代謝過程中會產(chǎn)生CO2而使稀釋液pH逐漸降低。精液常溫保存稀釋液的緩沖能力，尤其是對酸的緩沖能力將直接影響精液保存的效果。目前這方面開展的研究相對較少，尚缺乏理論控制及實際測量方法，本試驗開展的工作將對這一稀釋液參數(shù)的設(shè)計和篩選提供參考。通過對比試驗發(fā)現(xiàn)，當緩沖指數(shù)456時精液的保存效果最好。

4 結(jié)論

本試驗建立的稀釋液pH、滲透壓和緩沖指數(shù)的控制方法準確度分別達到97.1%～99.42%、98.7%～99.68%和98.48%～99.16%，可以滿足精液稀釋液配方設(shè)計的要求。pH 為6.28，滲透壓為347mmol／L，緩沖指數(shù)為456的9號稀釋液精液有效保存時間為160h，保存5d后的精液情期受胎率達到80.5%，與進口的BTS液差異不顯著，可以用于實際生產(chǎn)。

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