呂建軍，張?zhí)m清

（1.青海省海西州都蘭縣香日德鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，青海都蘭816100；2.青海省海西州德令哈市尕海鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，青海德令哈817000）

牛病毒性腹瀉（bovine viral diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起牛的一種高度接觸性傳染病，臨床上以發(fā)熱、腹瀉、消化道黏膜發(fā)炎和壞死、懷孕母畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎及畸型胎等為主要特征［1］。BVDV 進(jìn)入機(jī)體后可造成持續(xù)性感染與免疫抑制，持續(xù)感染牛的血清抗體為陰性，但卻終身帶毒與排毒［2］。牛傳染性鼻氣管炎（infectious bovine rhinotracheitis，IBR）是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）引起牛的一種以流鼻汁、呼吸困難、氣管粘膜發(fā)炎等呼吸道癥狀為主的接觸性傳染?。?］。IBRV 進(jìn)入機(jī)體后可潛伏于薦神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)造成潛伏感染，潛伏感染牛終生帶毒，遇到應(yīng)激時(shí)即向外排毒［4］。牦牛是高原牧區(qū)的主要家畜，是我國(guó)青藏高原特有的一個(gè)獨(dú)立物種，我國(guó)亦是擁有牦牛數(shù)量最多的國(guó)家，約占世界的94.8%［5］。BVDV 與IBRV 均可造成機(jī)體的持續(xù)感染，使機(jī)體處于免疫耐受狀態(tài)，此時(shí)機(jī)體雖不產(chǎn)生抗體，但卻帶毒、排毒，并可降低機(jī)體的免疫力，導(dǎo)致其他病原的繼發(fā)感染。為研究青海牦牛中BVDV 與IBRV 的感染現(xiàn)狀，有效保護(hù)青海牦牛及其牦牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，本研究對(duì)收集于青海省不同地區(qū)的252份牦牛血清樣品進(jìn)行了BVDV 和IBRV 的流行病學(xué)調(diào)查，以期為牦牛BVDV 和IBRV 的預(yù)防奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血 清 2013年1月至4月，采自青海省果洛州達(dá)日縣、班瑪縣、瑪多縣、久治縣，黃南州澤庫(kù)縣、尖扎縣，海南州共合縣、同德縣等的牦牛血清樣品共計(jì)252份。

1.1.2 病毒與試劑 牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒均由青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室保存；病毒基因組RNA 提取試劑盒、病毒DNA 提取試劑盒、一步法RT－PCR 試劑盒、rTaq酶、DNA Marker DL 2000均為TaKaRa公司產(chǎn)品；牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒為IDEXX 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 抗原的檢測(cè)

1.2.1.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)［6－7］采用的方法，分別設(shè)計(jì)合成針對(duì)BVDV、IBRV 的2對(duì)特異性檢測(cè)引物（見(jiàn)表1），并由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.1.2 病毒基因組的提取 按病毒RNA 提取試劑盒的操作方法與步驟提取檢測(cè)樣品的病毒基因組RNA。按病毒DNA提取試劑盒的操作方法與步驟提取檢測(cè)樣品的病毒基因組DNA。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequence table

1.2.1.3 BVDV 的RT－PCR 擴(kuò)增與檢測(cè)以提取的病毒RNA 為模板，參照一步法RT－PCR 檢測(cè)試劑盒的使用說(shuō)明和文獻(xiàn)［6］的方法進(jìn)行BVDV 的RT－PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。RT－PCR 反應(yīng)體系如下：2 xone step buffer 12.5 μL、BVDV P1 0.5 μL、BVDV P2 0.5μL、one step Enzyme Mix 0.5μL、RNA 5.0μL、RNase Free dH2O 6.0μL；RT－PCR反應(yīng)參數(shù)為：50 ℃45min；94 ℃4min；94 ℃30s，62 ℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃終止。RT－PCR 結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠核酸電泳和凝膠成像掃描儀進(jìn)行檢測(cè)與鑒定。

1.2.1.4 IBRV 的PCR 擴(kuò)增與檢測(cè) 以提取的病毒DNA 為模板，參照文獻(xiàn)［7］的方法進(jìn)行BVDV 的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系如下：10×PCR Buffer 2.5μL、dNTP 2.0μL、IBRV P1 0.5μL、IBRV P2 0.5μL、rTaq 0.5μL、DNA 5.0μL、H2O 14.0μL；PCR 反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃4min；94 ℃30s，58 ℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃終止。PCR 結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠核酸電泳和凝膠成像掃描儀進(jìn)行檢測(cè)與鑒定。

1.2.2 抗體的檢測(cè) 參照ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)的操作方法與判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行BVDV 和IBRV 抗體的檢測(cè)。

1.2.3 抗原與抗體檢測(cè)結(jié)果的比較 對(duì)抗原的RT－PCR／PCR 分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果與抗體的ELISA 免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析，掌握青海省不同地區(qū)牦牛BVDV 和IBRV 的感染情況，同時(shí)比較分析在流行病學(xué)調(diào)查中使用分子生物學(xué)方法檢測(cè)抗原與使用免疫學(xué)方法檢測(cè)抗體的優(yōu)缺點(diǎn)，尋找適合基層單位使用的檢測(cè)方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原檢測(cè)結(jié)果

對(duì)收集青海各縣市的252份牦牛血清樣品進(jìn)行BVDV和IBRV 抗原核酸檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。BVDV陽(yáng)性率介于6.45%～37.50%，總陽(yáng)性率為21.83%，部分陽(yáng)性樣品核酸電泳圖見(jiàn)圖1。由圖1知，陽(yáng)性樣品與BVDV陽(yáng)性毒株對(duì)照均能擴(kuò)增出288bp的特異性條帶。IBRV陽(yáng)性率介于3.22%～25.81%，總陽(yáng)性率為13.89%，部分陽(yáng)性樣品核酸電泳圖見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，陽(yáng)性樣品與BVDV 陽(yáng)性毒株對(duì)照均能擴(kuò)增出362bp的特異性條帶。BVDV／IBRV 混合感染樣品數(shù)為9份，混合感染率為3.57%。

表2 抗原檢測(cè)結(jié)果Table 2 Result of antigen detection

圖1 部分樣品BVDV RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2000；1－4.BVDV 陽(yáng)性樣品；5.陽(yáng)性對(duì)照；6.陰性對(duì)照Fig.1 RT－PCR products of part sample for BVDVM.DNA Marker DL 2000；1－4Positive samples of BVDV；5.Positive control；6.Negative control

圖2 部分樣品IBR PCR 擴(kuò)增結(jié)果M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2000；1－3.IBRV 陽(yáng)性樣品；4.陽(yáng)性對(duì)照；5.陰性對(duì)照Fig.2 PCR products of part sample for IBRVM.DNA Marker DL 2000；1－3.Positive samples of IBRV；4.Positive control；5.Negative control

2.2 抗體檢測(cè)結(jié)果

本研究所收集的青海省各縣市的252份牦牛血清樣品BVDV 和IBRV 抗體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，BVDV 抗體陽(yáng)性率介于6.45%～43.75%，總陽(yáng)性率為23.02%；IBRV 抗體陽(yáng)性率介于3.23%～32.26%，總陽(yáng)性率為14.29%。BVDV／IBRV 混合感染抗體陽(yáng)性率為3.57%。表明青海省不同地區(qū)均存在BVDV、IBRV 抗體陽(yáng)性牦牛，由于該牦牛未進(jìn)行BVDV、IBRV 疫苗的免疫接種，表明該抗體陽(yáng)性由BVDV、IBRV 感染所致。

表3 抗體檢測(cè)結(jié)果Table 3 Result of antibody detection

2.3 BVDV 抗原與抗體的比較結(jié)果

BVDV 的RT－PCR抗原檢測(cè)方法和ELISA 抗體檢測(cè)方法的比較結(jié)果顯示，有4份BVDV 抗原檢測(cè)陰性，但抗體檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；有1份BVDV 抗原檢測(cè)陽(yáng)性，但抗體檢測(cè)結(jié)果為陰性。該結(jié)果表明存在4份感染BVDV 后逐漸康復(fù)的牦牛，該牛體內(nèi)血清中抗原含量非常少，而野毒抗體效價(jià)卻較高，致使RT－PCR方法沒(méi)有檢測(cè)到BVDV 抗原。同時(shí)也存在1份BVDV 早期感染或隱性感染牦牛，該牛體內(nèi)存在BVDV 抗原，但還沒(méi)有產(chǎn)生BVDV 抗體。

2.4 IBRV 抗原與抗體的比較結(jié)果

IBRV 的RT－PCR 抗原檢測(cè)方法和ELISA 抗體檢測(cè)方法的比較結(jié)果顯示，有3份IBRV 抗原檢測(cè)陰性，但抗體檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；有2份IBRV 抗原檢測(cè)陽(yáng)性，但抗體檢測(cè)結(jié)果為陰性。該結(jié)果表明存在感染IBRV 后逐漸康復(fù)的牦牛，該牛體內(nèi)血清中抗原含量非常少，而野毒抗體效價(jià)卻較高，致使RTPCR 方法沒(méi)有檢測(cè)到IBRV 抗原。同時(shí)也存在IBRV 早期感染或潛伏感染牦牛，該牛體內(nèi)存在IBRV 抗原，但還沒(méi)有產(chǎn)生IBRV 抗體。

3 討論

近年來(lái)，隨著我國(guó)養(yǎng)牛規(guī)模的不斷擴(kuò)大，BVDV和IBRV 的感染日漸擴(kuò)大，鄧明亮等［10］于2012年對(duì)內(nèi)蒙古通遼市、遼寧大連市、青海省5個(gè)縣的840份血清進(jìn)行BVDV 抗原的檢測(cè)，共檢出抗原陽(yáng)性血清6份，平均陽(yáng)性率為0.71%，地區(qū)最高陽(yáng)性率為1.96%。而國(guó)內(nèi)對(duì)IBRV 抗原的流行病學(xué)調(diào)查資料較少，本研究采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)青海牦牛BVDV 和IBRV 感染情況首次進(jìn)行了調(diào)查分析，結(jié)果顯示BVDV 感染的平均陽(yáng)性率為21.83%，IBRV感染的平均陽(yáng)性率為13.89%，BVDV／IBRV 抗原混合感染陽(yáng)性率為3.57%。該調(diào)查結(jié)果與鄧明亮等［10］表現(xiàn)出了高度的一致性。表明青海省不同地區(qū)的牦牛均存在BVDV、IBRV 的感染，且感染在部分地區(qū)較為嚴(yán)重，應(yīng)引起相關(guān)部門的重視。

在BVDV 和IBRV 的抗體檢測(cè)和流行病學(xué)方面，研究學(xué)者已經(jīng)做了大量的研究，沈艷麗等［9］于2011年對(duì)玉樹(shù)地區(qū)六個(gè)縣采集的牦牛血清571份進(jìn)行了BVDV ELISA 抗體檢測(cè)，檢出陽(yáng)性43 份，平均陽(yáng)性率為7.5%，各縣都有不同程度的感染，其中治多、稱多、雜多三縣的陽(yáng)性率較高，均超過(guò)10%。葉成玉等［10］于2012年采用ELISA 檢測(cè)試劑盒對(duì)青海天峻縣的92份半野血牦牛血清進(jìn)行了BVDV 抗體檢測(cè)有35 份為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為38.04%，從35 份陽(yáng)性血清中隨機(jī)抽取樣品進(jìn)行PCR 抗原擴(kuò)增，結(jié)果均為陽(yáng)性。賀曉龍等［11］于2009年對(duì)青海省14個(gè)地區(qū)采集420份牛血清樣品進(jìn)行了BVDV 抗體檢測(cè)，檢出陽(yáng)性血清樣品200份，平均陽(yáng)性率為47.62%。韓志輝等［12］于2010年對(duì)大通種牛場(chǎng)和海晏地區(qū)采集的牦牛血清樣品進(jìn)行了BVDV 和IBRV 的抗體檢測(cè)，大通種牛場(chǎng)牦牛BVDV 陽(yáng)性率為23.42%，IBRV 陽(yáng)性率為65.45%，海晏縣牦牛群中BVDV 陽(yáng)性率為l9.86%，IBRV 陽(yáng)性率為4.96%。本研究次應(yīng)用ELISA 免疫學(xué)檢測(cè)方法對(duì)青海省不同地區(qū)的252份牦牛血清樣品進(jìn)行了BVDV 和IBRV 抗體檢測(cè)的結(jié)果顯示，BVDV抗體平均陽(yáng)性率為23.02%，IBRV 抗體平均陽(yáng)性率為14.29%。該調(diào)查結(jié)果與上述調(diào)查結(jié)果均表現(xiàn)出了高度的一致性，表明我國(guó)青海牦牛中BVDV、IBRV 感染的抗體陽(yáng)性率較高，且地區(qū)分布差異較大，在部分地區(qū)較為嚴(yán)重。

BVDV 和IBRV 的感染給我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因目前還沒(méi)有國(guó)產(chǎn)的安全有效的BVDV 和IBRV 疫苗，故及時(shí)診斷并發(fā)現(xiàn)和淘汰攜帶病毒的動(dòng)物成為BVDV 和IBRV 防制的主要方法。對(duì)于BVDV 和IBRV 的診斷，筆者建議首先應(yīng)采用血清學(xué)檢測(cè)方法對(duì)畜群進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)，再重點(diǎn)對(duì)陽(yáng)性畜群內(nèi)的抗體檢測(cè)陰性牛進(jìn)行病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)，以及時(shí)發(fā)現(xiàn)和剔除隱性感染牛，逐步實(shí)現(xiàn)牛群的凈化。

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