蔣超 吳志宏 邱貴興 王以朋

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京 100730）

間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞因子的研究進(jìn)展

蔣超 吳志宏 邱貴興 王以朋*

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京 100730）

軟骨的破壞、缺損是包括骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）在內(nèi)的多種骨科疾病的重要病理改變。由于軟骨特殊的解剖及組織特性，如缺乏血管和淋巴管的分布，使得其自我修復(fù)能力異常不足，因此通過人工方法修復(fù)軟骨破壞具有重要臨床意義。近年來，隨 著 間充 質(zhì)干細(xì) 胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的發(fā)現(xiàn)和研究的深入，其來源廣泛、良好的增殖能力、多分化潛能、與各種3D支架材料具有良好的生物相容性等特性[1-5]，使得其在軟骨修復(fù)應(yīng)用中具有令人期待的潛力。除了從骨髓中獲取該細(xì)胞，目前已經(jīng)從人體多種組織分離、獲得了此類細(xì)胞，如脂肪、關(guān)節(jié)液、骨膜、胎盤組織、肝、脾、胰腺等[6-8]。有文獻(xiàn)報(bào)道，MSCs不具有免疫原性[9]，甚至可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能，起到免疫抑制作用[10-12]。此外，各種成軟骨分化刺激因子的發(fā)現(xiàn)、應(yīng)用及各種3D支架的探索，使得MSCs結(jié)合各種技術(shù)在軟骨修復(fù)的臨床應(yīng)用中顯示出極大的可能價(jià)值。

生長因子作為成軟骨分化培養(yǎng)基不可缺少的部分，吸引了眾多學(xué)者的關(guān)注。其在MSCs成軟骨分化過程中起到的作用隨著不同的生長因子、使用濃度、MSCs的來源和細(xì)胞狀態(tài)等條件的變化而變化。目前研究較多的生長因子包括轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF），成纖維生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF），骨 形 態(tài) 發(fā) 生 蛋 白 家 族（bone morphohenic proteins，屬于 TGF-β超家族）等 。此外，其他生物因子如地塞米松、抗壞血酸等[13]已被證實(shí)為成軟骨分化培養(yǎng)基的基本添加劑，在此不再詳細(xì)討論。

1 TGF-β

TGF-β家族通過與受體異質(zhì)性復(fù)合體（receptor heteromeric complex）的 相 互 作 用，激活 R-Smad 蛋白。后者與 Co-Smad 聯(lián)合，此激活的復(fù)合體隨后被轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)從而參與調(diào)節(jié)MSCs的增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成。TGF-β被認(rèn)為與地塞米松同時(shí)作為成軟骨分化培養(yǎng)基的必要成分[14]。已有大量研究表明，微量的 TGF-β即可使蛋白聚糖（proteoglycan）和Ⅱ型膠原的合成明顯增加[15]，TGF-β促進(jìn) MSCs成軟骨分化的細(xì)胞數(shù)量增加，且提高其生存能力[16]。體外研究證實(shí)，TGF-β可以使成軟骨分化早期相關(guān)基因 SOX-9的表達(dá)水平升高[17]；同時(shí)伴隨著軟骨細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原的基因表達(dá)水平上升，而Ⅱ型膠原是透明質(zhì)酸軟骨合成的重要生物標(biāo)志物；另一軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)成分聚蛋白聚糖（aggrecan）的表達(dá)也具有類似的改變；而成骨相關(guān)基因Ⅰ型膠原的表達(dá)水平則進(jìn)一步明顯下降，由此顯示TGF-β的另一作用即保持MSCs誘導(dǎo)而來的軟骨細(xì)胞透明質(zhì)酸軟骨表型[18]。在作用時(shí)間方面，TGF-β主要作用于成軟骨分化早、中期，因此有學(xué)者認(rèn)為，TGF-β不需要在誘導(dǎo)全程添加[19]，但考慮到其具有保持軟骨細(xì)胞處于肥大增殖前狀態(tài)[20]，故推測其可能對MSCs成軟骨分化全程具有重要作用。

盡管有學(xué)者認(rèn)為 TGF-β2 及 TGF-β3 的促軟骨分化能力可能比 TGF-β1 更有勢[21]，但多數(shù)認(rèn)為 TGF-β的促軟骨分化能力與其亞型無關(guān)。目前研究表明，在單層平面誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，MSCs成軟骨分化效率與TGF-β的濃度和培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)，而在立體培養(yǎng)環(huán)境中，10 ng/ml的 TGF-β濃度足以順利地促進(jìn) MSCs成軟骨分化[21,22]。

然而，鑒于TGF-β可能需要參與成軟骨分化誘導(dǎo)全程，且其在體內(nèi)的運(yùn)輸、代謝較體外實(shí)驗(yàn)更加復(fù)雜，故目前用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)需要一個(gè)合適的緩釋體系，以避免反復(fù)的關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射帶來的痛苦和關(guān)節(jié)腔感染等嚴(yán)重并發(fā)癥。

2 BMPs

大部分BMPs屬于TGF-β超家族，通過影響軟骨祖細(xì)胞定性和分化，在骨形態(tài)發(fā)生過程中起到重要作用，故命名“骨形態(tài)發(fā)生蛋白”。BMPs通過胞膜上相關(guān)受體作用，促發(fā)Smads通路相關(guān)信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，從而增強(qiáng)骨與軟骨的發(fā)生發(fā)育[23]。臨床上已明確某些骨骼系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)疾病的發(fā)生與BMPs的基因突變有關(guān)，比如軟骨發(fā)育不良；而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，BMPs 缺乏也使得動(dòng)物出現(xiàn)骨骼系統(tǒng)缺陷[24]。研究表明 BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7 與 TGF-β在誘導(dǎo)MSCs成軟骨分化過程中具有協(xié)同作用，但是單獨(dú)的BMPs在常規(guī)微球法誘導(dǎo)過程中卻無法有效促進(jìn)MSCs成軟骨分化，提示其促成軟骨分化作用依賴于其他細(xì)胞因子的存在[25]。此外，不同來源的 MSCs 其成軟骨分化過程中對BMPs的依賴程度也不一樣：Richter等[21]曾報(bào)道骨髓來源的 MSCs其成軟骨分化誘導(dǎo)不依賴于 BMPs，而脂肪和關(guān)節(jié)滑液來源的MSCs成軟骨分化過程則需要BMP-6的參與。

在BMPs家族中，BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-13、BMP-14已被證實(shí)在體外具有誘導(dǎo)MSCs成軟骨分化作用。BMP-7可加速軟骨細(xì)胞重塑，在動(dòng)物（兔子）實(shí)驗(yàn)中用于修復(fù)軟骨全層缺損；而聯(lián)合微骨折處理能增強(qiáng) BMP-7 修復(fù)軟骨全層缺損[26]。BMP-2、BMP-4、BMP-6 促進(jìn)Ⅱ型膠原轉(zhuǎn)錄水平，誘導(dǎo) MSCs成 軟 骨 分 化[27,28]。 目 前 對 于 不 同 亞 型 BMPs 誘 導(dǎo)MSCs成軟骨分化能力大小仍存在爭議，此前有文獻(xiàn)通過比較不同亞型BMPs誘導(dǎo)組微球大小、重量、蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的表達(dá)水平，認(rèn)為 BMP-2 促進(jìn)骨髓來源 MSCs成軟骨分化能力要優(yōu)于 BMP-4、BMP-6[29]。

盡管有大量文獻(xiàn)支持BMPs具有單獨(dú)促進(jìn)MSCs成軟骨分化能力或與其他因子如TGF-β協(xié)同作用，但大部分BMPs同時(shí)具有誘導(dǎo)成骨的作用。BMPs異位骨形成是需要繼續(xù)研究和克服的一個(gè)重要問題，尤其在關(guān)節(jié)腔內(nèi)異位骨形成的后果更加嚴(yán)重。Hannallah 等[30]的研究 認(rèn) 為 Noggin（BMP 拮抗劑）可 能 抑制BMP-4引起的異位骨化作用。

3 FGF

成纖維生長因子（FGF），又稱肝素結(jié)合生長因子（heparin binding growth factor）在人體內(nèi)有多種異構(gòu)體，其廣泛參與維持對包括骨骼系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)在內(nèi)的多個(gè)系統(tǒng)的正常結(jié)構(gòu)和功能。FGF作用于絡(luò)氨酸激酶FGF受體（FGFRs），從而激活 PI3 激酶、MARKs、Src、ERK 和 p38 等信號通路及因子[31]。FGF 基因缺陷與包括軟骨發(fā)育不良、骨關(guān)節(jié)炎等多個(gè)骨科相關(guān)疾病的發(fā)生有關(guān)。

FGF-2 和 FGF-18 在維持軟骨基質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡中起到重要作用。添加 FGF-2 因子可以促進(jìn) MSCs增殖加快，同時(shí)誘導(dǎo)其成軟骨分化；鈣離子依賴性信號通路調(diào)控 FGF-18 的表達(dá)，后者促進(jìn) MSCs分化的同時(shí)抑制其增殖[32]。在 Cucchiarini等[33]的研究中，他們通過重組腺病毒介導(dǎo)FGF-2基因轉(zhuǎn)染，實(shí)現(xiàn)了軟骨細(xì)胞對兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)的修復(fù)。

目前關(guān)于FGF-2與其他誘導(dǎo)軟骨分化的細(xì)胞因子的聯(lián)合作用仍然存在爭議[34-37]。文獻(xiàn)報(bào)道 FGF-2 和TGF-β1的聯(lián)合作用可以在體外實(shí)驗(yàn)中加快細(xì)胞增殖和 新 軟 骨 的 形 成[34]；在 異 體 移 植 模 型 中 ，F(xiàn)GF-2 與IGF-1 共轉(zhuǎn)染促進(jìn)軟骨修復(fù)過程[35]。然而，F(xiàn)GF-2 與BMP-6聯(lián)合作用則會抑制后者的成軟骨分化誘導(dǎo)能力[36]；亦有文獻(xiàn)認(rèn)為 FGF-2 會抑制 TGF-β，減弱后者在鼠來源 MSCs的誘導(dǎo)成軟骨分化能力[29]。由此看來，盡管FGF參與軟骨形成和MSCs成軟骨分化過程，但其與其他細(xì)胞因子間的相互作用需要進(jìn)一步研究，以明確其用于體內(nèi)外MSCs成軟骨分化過程的用法和用量。

4 IGF

胰島素樣生長因子（IGF）家族包括兩種多肽（IGF-1 和 IGF-2）、兩 種 特 異 性 受 體（IGF1R 和IGF2R）、六種結(jié)合蛋白（IGFBPs）以及 IGFBP 蛋白酶構(gòu)成。IGF-1與IGF1R結(jié)合后激活多條通路，參與人體多部位組織的同化作用，促進(jìn)纖維軟骨細(xì)胞的增生以及透明質(zhì)酸軟骨的成熟[38,39]，在人及動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn) IGF-1 基因突變與嚴(yán)重的骨骼發(fā)育遲滯相關(guān)[40]。

有關(guān)IGF促軟骨形成的體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，IGF能顯著提高聚蛋白聚糖、Ⅱ型膠原和黏多糖等軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要成分的合成[41,42]；將 IGF-1 與Ⅱ型膠原復(fù)合物填充于軟骨缺損區(qū)，可顯著增加軟骨修復(fù)的效率和質(zhì)量[43]。Fukumoto 等[44]的研究表明，IGF-1 可以顯著提高 MSCs的成軟骨分化程度，且 IGF-1 與TGF-β具有協(xié)同作用，兩者合用較單獨(dú)添加 IGF-1 或TGF-β1 能最大程度提高 MSCs細(xì)胞增殖和成軟骨分化程度。當(dāng) MSCs單獨(dú)受TGF-β3刺激時(shí)候，其分化過程中Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原蛋白的基因表達(dá)水平同時(shí)升高，但是當(dāng)同時(shí)受 TGF-β3 和 IGF-1 作用時(shí)，MSCs分化過程中Ⅰ型膠原的表達(dá)水平明顯下降，而Ⅱ型膠原的表達(dá)水平升高。類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣出現(xiàn)在 BMPs和 TGF-β合用時(shí)。而在 Indrawattana 等[45]的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)人員通過體外微球法誘導(dǎo)骨髓MSCs成軟骨分化，研究包括 TGF-β、BMP-6、IGF-1 在內(nèi)的三種生長因子對MSCs成軟骨分化的相互作用。他們的研究結(jié)果認(rèn)為骨髓MSCs可以很好地成軟骨分化，而 IGF-1或 BMP-6與 TGF-β3 聯(lián)合作用，可以更好的促進(jìn)MSCs的成軟骨分化。由此認(rèn)為生長因子的聯(lián)合作用可能是MSCs體外成軟骨分化的關(guān)鍵。

5 展望

本文歸納總結(jié)了近幾年國內(nèi)外對促進(jìn)MSCs成軟骨分化相關(guān)生長因子的研究現(xiàn)狀，目前已經(jīng)明確包括TGF-β、BMPs、FGF、IFG等在內(nèi)的多個(gè)生長因子參與MSCs在體內(nèi)外的成軟骨分化過程。各生長因子的單獨(dú)作用和相應(yīng)機(jī)制已經(jīng)研究比較深入，但對于其相互之間的作用和作用方式仍需要未來進(jìn)一步的研究，以期獲得促進(jìn)MSCs成軟骨分化的生長因子最佳組合；此外新的、更有效的促進(jìn)MSCs成軟骨分化的生長因子仍需要被研究發(fā)現(xiàn)，以進(jìn)一步提高M(jìn)SCs在體內(nèi)外成軟骨分化的效率和質(zhì)量。

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*通信作者：王以朋，E-mail:jiangchao2189@sina.com