唐勇梁霞綜述 王琪審校

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院1泌尿外科，2放療科，3實驗研究部

綜述

慢病毒載體的演化、生產(chǎn)及臨床應(yīng)用

唐勇1梁霞2△綜述 王琪3審校

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院1泌尿外科，2放療科，3實驗研究部

慢病毒載體是在人類免疫缺陷病毒-1基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，能夠穩(wěn)定、高效地將目的基因轉(zhuǎn)導入人或動物的原代細胞或不分裂細胞中持續(xù)表達。經(jīng)過三代演變，其轉(zhuǎn)染的效率及安全性得到了明顯提高。本文對慢病毒載體的演化、生產(chǎn)優(yōu)化及其在腫瘤基因等治療中的應(yīng)用進行綜述。

慢病毒載體；演化；生產(chǎn)；臨床應(yīng)用；腫瘤基因治療

慢病毒（lentivirus）屬逆轉(zhuǎn)錄病毒之一，包括人艾滋病毒、猴艾滋病毒、羊Visna/Maedi病毒等7個亞屬，其中對人艾滋病毒的生活史及基因結(jié)構(gòu)的了解最為清楚。慢病毒在宿主細胞內(nèi)，能以病毒RNA為模板在自身反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，再以此cDNA為模板合成雙鏈DNA，經(jīng)環(huán)化后通過病毒整合酶作用整合在宿主細胞的染色體上并長期表達。因此，以慢病毒基因組為基礎(chǔ)，除去其復制所需要的基因，代之以治療基因和選擇性標志物構(gòu)建而成的慢病毒載體（lentiviral vector，LvV），其特點為轉(zhuǎn)移基因片段容量大、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)、安全性較好，不僅能感染分裂細胞，還能感染不分裂細胞（如神經(jīng)細胞、造血干細胞、肌纖維細胞和肝細胞等），并可穩(wěn)定整合于靶細胞的基因組，治療基因表達時間長。因此，慢病毒載體已成為當前基因治療中基因轉(zhuǎn)移載體研究的熱點，人們對它寄予了攻克和治愈腫瘤的厚望。本文以人類免疫缺陷病毒-1（human immunodeficiency virus-1，HIV-1）為代表對慢病毒載體的演化、生產(chǎn)優(yōu)化及其在HIV及腫瘤基因治療中的應(yīng)用作一綜述。

1 慢病毒載體的演化

慢病毒作為復雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒家族中的一個成員，目前廣泛用于基因載體及臨床研究。LvV是在HIV-1基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能高效地將目的基因轉(zhuǎn)導入人或動物的原代細胞系或非分裂細胞中穩(wěn)定、持續(xù)表達。LvV自1996年在體內(nèi)用于轉(zhuǎn)導如神經(jīng)元等不可再生細胞后得到快速發(fā)展。

過去幾十年中，LvV已連續(xù)更新了三代，取得了很大的發(fā)展。LvV每次更新都使載體的生物安全性得到提高。在第一代LvV系統(tǒng)，包裝質(zhì)粒編碼了除被膜基因外的其它所有HIV基因。不同病毒來源的異質(zhì)性被膜基因能夠從體外二次包裝質(zhì)粒表達而獲得。在第二代載體系統(tǒng)中，出于生物安全性考慮，去除了8種HIV-1基因中的4種基因（vif、vpr、vpu和nef），只有tat、rev、gag和pol 4種基因得到保存并可進行轉(zhuǎn)錄。tat和rev基因的主要功能是通過轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄機制參與病毒轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，而gag和pol基因分別編碼慢病毒的結(jié)構(gòu)和酶成分。對這些基因的篩選去除了HIV病毒主要的毒性，很大程度上提高了載體的安全性。LvV更大的進步是刪除了一部分3′端長末端重復序列（long terminal repeat，LTR），此部分3′LTR能使轉(zhuǎn)染載體的5′LTR端的載體基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄，但整合的載體序列會使轉(zhuǎn)染載體失去它的LTR啟動子。這些自我滅活的載體需要自身的啟動子來激活基因表達，但在轉(zhuǎn)染細胞中它能去除載體全部轉(zhuǎn)錄時所生成產(chǎn)物導致的危險。第二代LvV包裝系統(tǒng)的這些特點，使其具有安全、高效及易操作性，并廣泛用于實驗研究。第三代LvV系統(tǒng)通過去除tat基因，保留gag、pol和rev基因，從而增加了質(zhì)粒的安全性，并逐步用于臨床。tat基因的丟失也需要含有不依賴tat基因啟動的勞斯肉瘤病毒（rous sarcoma virus，RSV）啟動子的載體5′LTR端的替換。盡管第三代LvV系統(tǒng)的安全性已經(jīng)大大提高，但第二代LvV系統(tǒng)因其P2條件下的高安全性仍然廣泛應(yīng)用于實驗室。

2 慢病毒載體的生產(chǎn)

2.1 目前慢病毒載體生產(chǎn)存在的問題

一般來說，標準的LvV產(chǎn)生需要依賴輔助質(zhì)粒（包括輔助質(zhì)粒、糖蛋白編碼的信使質(zhì)粒及LvV質(zhì)粒）對人胚胎來源的腎細胞（human embryonic kidney，HEK 293T）進行瞬時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞后產(chǎn)生的慢病毒微粒釋放到HEK 293T細胞的培養(yǎng)上清液中。盡管近幾年，有新的LvV生產(chǎn)方法及一些使用特殊轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染方法，如Lipofectamine 2000［1］、LipofectamineTM、SuperFect［2］、FuGENE和GeneJammer transfection reagent［3］等已經(jīng)成功用于LvV的生產(chǎn)，但由于高成本限制了其廣泛使用。因此，使用磷酸鈣沉淀瞬時轉(zhuǎn)染方法仍是LvV最常用的生產(chǎn)方法。這種方法最主要的缺點是需要大量的DNA和依賴最合適pH值的HEPES緩沖液，而HEPES緩沖液的pH值會隨著時間的推移發(fā)生改變，從而導致轉(zhuǎn)染效率差異較大，LvV的滴度亦有較大的不同［4］。與此同時，盡管LvV包裝系統(tǒng)的安全性及發(fā)展都已取得很大的進步，但未成熟的LvV的滴度平均只有106～108TU/ml［5］，這在體內(nèi)是遠遠不夠的，還需要更多的介質(zhì)、細胞數(shù)和質(zhì)粒DNA來生成未成熟的慢病毒。而相對較低的慢病毒轉(zhuǎn)染效率是目前LvV發(fā)展中一個較大的瓶頸。因此，生產(chǎn)高滴度、高質(zhì)量的LvV仍然是耗時、耗資的，而LvV包裝系統(tǒng)的技術(shù)要應(yīng)用于未來，則需要改進LvV的生產(chǎn)方法以獲得高滴度的載體。

2.2 慢病毒常用的生產(chǎn)方法

通常LvV的生產(chǎn)有兩種方法：一種是依賴有著穩(wěn)定載體包裝系統(tǒng)的細胞系；另一種是瞬時轉(zhuǎn)染方法。盡管目前已有幾種穩(wěn)定載體包裝系統(tǒng)的細胞系被培養(yǎng)出來［6］，但因某些原因限制了這些細胞系的應(yīng)用。首先，需要較長周期才能培養(yǎng)出穩(wěn)定載體包裝系統(tǒng)的細胞系［7］；其次，轉(zhuǎn)基因或載體成分可能含有毒性而不適合用于含有穩(wěn)定載體包裝系統(tǒng)的細胞系［8］；第三，每構(gòu)建一種新的載體都需要一種新的載體包裝系統(tǒng)細胞系；第四，穩(wěn)定的載體包裝系統(tǒng)的細胞系通常產(chǎn)生的病毒滴度較低，且缺乏能夠用于長期培養(yǎng)的穩(wěn)定性，從而使長期培養(yǎng)存在一定問題［5］。而質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)染能使慢病毒的生產(chǎn)變?yōu)楹唵魏凸?jié)約時間，從而避免了含有穩(wěn)定載體包裝系統(tǒng)的細胞系長周期的培養(yǎng)［9］。另外，在瞬時轉(zhuǎn)染載體體系中，許多轉(zhuǎn)基因和信使糖蛋白能夠很容易被置換掉［10］，因此通過瞬時轉(zhuǎn)染生產(chǎn)LvV的方法仍然最常用。

2.2.1 聚乙稀亞胺介導的慢病毒生產(chǎn) 近年來，由聚乙稀亞胺（polyethylenimine，PEI）介導的瞬時轉(zhuǎn)染方法也用于LvV生產(chǎn)［11］，并作為一種轉(zhuǎn)染成分用于重組病毒載體（如腺病毒載體或LvV）［12，13］。由PEI介導的瞬時轉(zhuǎn)染方法用于LvV生產(chǎn)有幾個優(yōu)點：首先，PEI價格相對便宜，能使其更廣泛用于實驗室；其次，PEI較穩(wěn)定，不需要依賴pH值，從而能保證確切的、較高的轉(zhuǎn)染率［14］；第三，PEI已被證明在黏附和懸浮的細胞中都能被有效轉(zhuǎn)導［15］。

基于PEI介導的瞬時轉(zhuǎn)染方法，最適宜的條件包括介質(zhì)的選擇、收獲的時期、細胞的密度、質(zhì)粒DNA的數(shù)量以及滴度的測定方法都能被優(yōu)化以達到最佳的優(yōu)化。轉(zhuǎn)染過程中對這些條件的優(yōu)化能使LvV的滴度增加約100倍。使用這些優(yōu)化方法，使LvV的滴度和使用CaPO4介導的瞬時轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的載體滴度是一樣的。相比CaPO4介導的瞬時轉(zhuǎn)染，PEI介導的瞬時轉(zhuǎn)染更易在培養(yǎng)液中獲得，而且轉(zhuǎn)染不需要依賴pH值，轉(zhuǎn)染細胞亦不需要在轉(zhuǎn)染后頻繁地更換培養(yǎng)液。同時，要得到相同數(shù)量LvV所需要的DNA數(shù)量比CaPO4介導的瞬時轉(zhuǎn)染方法少10倍，且可重復性和一致性更好。因此，使用PEI介導的瞬時轉(zhuǎn)染能使轉(zhuǎn)染過程變得簡單，顯著減少了質(zhì)粒DNA的數(shù)量和縮短了LvV的生產(chǎn)時間。

在慢病毒生產(chǎn)過程中，PEI介導的瞬時轉(zhuǎn)染過程的條件優(yōu)化需要考慮以下因素。比如PEI中的氮和DNA中磷的比例（N/P）［16］、DNA的數(shù)量［17］等。此外，每個培養(yǎng)板PEI的量可能會動態(tài)改變［7］，DNA混合物與轉(zhuǎn)染細胞的比例也是非常重要的考量因素［18］。同時，轉(zhuǎn)染過程中培養(yǎng)液是否含有血清亦是需要考慮的優(yōu)化條件之一。雖然，LvV產(chǎn)生過程中由PEI介導的瞬時轉(zhuǎn)染可在含血清的培養(yǎng)液中進行，但亦有在不含血清的培養(yǎng)液中進行瞬時轉(zhuǎn)染的報道［18］。在瞬時轉(zhuǎn)染后，LvV的收獲時間可在48～72 h內(nèi)進行，目前研究發(fā)現(xiàn)LvV在轉(zhuǎn)染后48 h可開始被收獲［13，17，19］。在PEI介導瞬時轉(zhuǎn)染過程中，不同的細胞密度產(chǎn)生的病毒滴度也不同，不同的載體需要的細胞密度也不同。根據(jù)Kuroda等［17］研究結(jié)果，當HEK 293T細胞的密度為每15 cm的培養(yǎng)板上（1～2）×107TU/ml時，LvV的滴度相對受影響較少，這些數(shù)據(jù)表明在LvV產(chǎn)生過程中細胞的密度也是影響因素之一。在培養(yǎng)液中增加蛋白能提高轉(zhuǎn)染效率［20］，但這些添加物對于LvV的產(chǎn)生是否有好處，尚需進一步實驗證實。不同的LvV包裝細胞用于生產(chǎn)慢病毒的效率并不相同，盡管HEK 293T細胞已被廣泛用于LvV的產(chǎn)生，但HeLa細胞和XDC293細胞亦可用作重組病毒產(chǎn)生過程中載體包裝細胞系［12］。

在應(yīng)用PEI介導的瞬時轉(zhuǎn)染方法時，藥物毒性亦是需要考慮的因素［18］。PEI的分子量決定了其有效性和毒性。分子量小的PEI無毒性，但有效性低。Toledo等［19］研究發(fā)現(xiàn)當使用25kDa大小的PEI時能產(chǎn)生大約1×107TU/ml濃度的LvV。另有研究發(fā)現(xiàn)交聯(lián)的PEI能增加基因切割的效率［16］。

在病毒滴度檢測優(yōu)化方面，將eGFP基因轉(zhuǎn)染給小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblast cell，NIH 3T3）能獲得LvV滴度。Barde等［21］研究發(fā)現(xiàn)檢測最佳轉(zhuǎn)染滴度的方法是用能編碼GFP的質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染。包含轉(zhuǎn)基因mRNA水平測定在內(nèi)的不同LvV滴定法都和慢病毒生產(chǎn)的效率有關(guān)，可以用來測定非熒光轉(zhuǎn)基因的滴度［22］。與此類似的是，熒光標記的LvV的濃度則能通過實時熒光定量PCR測定。當LvV僅能感染小鼠的細胞時，可利用NIH3T3細胞來測定LvV滴度。而當LvV表達水皰性口炎病毒G蛋白時，它也能感染人的細胞，因此HeLa細胞也可用于測定LvV滴度［21］。

除了提高轉(zhuǎn)染效率外，我們也能通過對細胞培養(yǎng)上清液進行處理來純化或增加病毒的濃度，從而提高LvV的滴度。其中包括用不含血清的培養(yǎng)液及物理濃縮法，該法包括超速離心［10］、HYPERFlask vessels［23］或過濾、透析過濾［13］。

2.2.2 PEI與 CaPO4介導的慢病毒生產(chǎn)的比較 在CaPO4介導的瞬時轉(zhuǎn)染所需的最適宜條件中，pH值是最為重要的參數(shù)。事實上，CaPO4介導的瞬時轉(zhuǎn)染的效價也受信使質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)影響。從水皰性口炎病毒G糖蛋白的信使蛋白獲得的效價比從狂犬病G糖蛋白的信使蛋白獲得的效價高10倍以上［24］。CaPO4介導的瞬時轉(zhuǎn)染的效價同樣和CaPO4的濃度、復合物形成時間及細胞周期有關(guān)［25］。

PEI介導的瞬時轉(zhuǎn)染和CaPO4介導產(chǎn)生的LvV滴度是一樣的。Toledo等［19］研究也發(fā)現(xiàn)盡管使用PEI能產(chǎn)生更高的載體滴度，但PEI介導的瞬時轉(zhuǎn)染的效價并不比CaPO4介導的好。但在利用HEK 293T細胞和HeLa細胞產(chǎn)生腺病毒時，相比CaPO4，線性PEI是一種更好的轉(zhuǎn)染試劑［12］。通常，由瞬時轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的LvV滴度是106～107TU/ml［17，18］。LvV滴度降低，其中可能的主要原因是出于安全性考慮使用了親水性信使蛋白對LvV進行重構(gòu)。已有研究證明這種信使蛋白產(chǎn)生的載體滴度比水皰性口炎病毒G糖蛋白產(chǎn)生的載體滴度低［17，20］。盡管還有很多因素能提高載體滴度，但PEI是目前最為有效的方法。

3 慢病毒載體的臨床應(yīng)用

目前，LvV作為一種重要的工具應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因及基因干擾治療中。LvV能轉(zhuǎn)染靜止期細胞、分裂周期長的細胞及不分裂的細胞（如造血干細胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞等），也能整合到宿主細胞基因，使其能長時間地表達轉(zhuǎn)基因和有較強的包裝能力。這些均使LvV能較好地用于基因治療。整合到宿主中的慢病毒不會引起炎癥反應(yīng)或免疫反應(yīng)，從而能在宿主中、不同組織中長期表達轉(zhuǎn)基因。此外，正常的腫瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在胚胎時期不表達，這限制了其在小鼠轉(zhuǎn)基因?qū)W發(fā)展中的應(yīng)用。而LvV在胚胎時期可以表達，因此能在體外被重建而用于轉(zhuǎn)基因動物的研究［25］。近幾年，已經(jīng)開展LvV用于治療HIV感染患者的Ⅰ期臨床試驗［23］。

2009年Cartier等［26］利用LvV編碼野生型ABCD1基因治療2例腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良患者，治療24個月及30個月后患者檢查結(jié)果提示治療成功且無明顯毒副反應(yīng)。Chen等［27］的研究證實相對于腺病毒，VSV-G慢病毒系統(tǒng)由于其轉(zhuǎn)染的高效性，使其更適合于肺癌的轉(zhuǎn)基因治療。Gambari等［28］利用LvV將β-球蛋白基因轉(zhuǎn)導至人的造血干細胞中治療β-地中海貧血，使1例19歲的β-地中海貧血患者在接受基因治療后，無須定期輸血4年后仍健康生存。利用LvV攜帶絡(luò)氨酸羥化酶、三磷酸鳥苷環(huán)化水解酶、芳香L-氨基酸脫羧酶作用于腦紋狀體治療帕金森氏病的Ⅰ期、Ⅱ期臨床試驗均取得了較好的效果［29］。

將腫瘤相關(guān)抗原轉(zhuǎn)染樹突狀細胞（dendritic cell，DC）引起對腫瘤的特異性免疫應(yīng)答是腫瘤免疫治療的方法之一，而腫瘤相關(guān)抗原轉(zhuǎn)染DC細胞以LvV為首選。Dullaers等［30］研究發(fā)現(xiàn)慢病毒轉(zhuǎn)染OVA基因骨髓來源的DC細胞介導強烈的細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxiclymphocyte，CTL）抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤形成，制約腫瘤向外生長，相同的方法將三種肝癌相關(guān)抗原進行轉(zhuǎn)染，激活CD4+和CD8+T細胞對三種抗原作出免疫應(yīng)答，導致腫瘤縮小，三種抗原在肝癌中異常豐富表達，為未經(jīng)修飾的自身抗原，作者推測三種抗原的共同表達打破了抗原丟失引起的腫瘤逃逸現(xiàn)象。

4 展望

目前主要用于腫瘤基因治療載體有病毒學載體和非病毒學載體。非病毒學的基因轉(zhuǎn)移方法效率較低，在用于人體試驗的腫瘤基因治療方案中絕大多數(shù)是以病毒學方法進行基因轉(zhuǎn)移。而LvV與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，具有許多優(yōu)點，攜帶的外源基因在宿主中表達時間長、毒性低、可攜帶的外源基因片段大、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，在靶細胞的免疫治療中具有較好的應(yīng)用前景。LvV介導的免疫治療，不但可以用于治療腫瘤，還可以用于治療感染性疾病、自身免疫性疾病及器官移植排斥反應(yīng)。然而，在慢病毒應(yīng)用于臨床治療之前，有許多問題尚待解決，如生物安全、生物干擾和靶向性問題等。近年來，生物安全和生物干擾問題取得了較大進展，LvV基因重組、繁殖衰減和自身失活避免了慢病毒的體內(nèi)重組，位點專一的整合和非整合的慢病毒消除了潛在的病毒介導的基因突變。目前，最大的困難是病毒感染的靶向性問題，需要我們進一步研究新的LvV系統(tǒng)及改進其生產(chǎn)、濃縮流程，才能使其更有效地應(yīng)用于臨床研究。

［1］ Shin KJ，Wall EA，Zavzavadjian JR，et al.A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（37）：13759-13764.

［2］ Coleman JE，Huentelman MJ，Kasparov S，et al.Efficient large-scale production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors for use in vivo［J］.Physiol Genomics，2003，12（3）：221-228.

［3］ Kosaka Y，Kobayashi N，F(xiàn)ukazawa T，et al.Lentivirus-based gene delivery in mouse embryonic stem cells［J］.Artif Organs，2004，28（3）：271-277.

［4］ Lee JH，Welsh MJ.Enhancement of calcium phosphate-mediated transfection by inclusion of adenovirus in coprecipitates［J］.Gene Ther，1999，6（4）：676-682.

［5］Cronin J，Zhang XY，Reiser J.Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping［J］.Curr Gene Ther，2005，5（4）：387-398.

［6］ Kumar M，Bradow BP，Zimmerberg J.Large-scale production of pseudotyped lentiviral vectors using baculovirus GP64［J］.Hum Gene Ther，2003，14（1）：67-77.

［7］ Ni Y，Sun S，Oparaocha I，et al.Generation of a packaging cell line forprolonged large-scaleproduction ofhigh-titerHIV-1-based lentiviral vector［J］.J Gene Med，2005，7（6）：818-834.

［8］ S inn PL，Sauter SL，McCray PB Jr.Gene therapy progress a nd prospects：development of improved lentiviral and retroviral vectorsdesign，biosafety，and production［J］.Gene Ther，2005，12（14）：1089-1098.

［9］ Mitta B，Rimann M，F(xiàn)ussenegger M.Detailed design and comparative analysis of protocols for optimized production of high-performance HIV-1-derived lentiviral particles［J］.Metab Eng，2005，7（5-6）：426-436.

［10］ Sena-Esteves M，Tebbets JC，Steffens S，et al.Optimized large-scale production of high titer lentivirus vector pseudotypes［J］.J Virol Methods，2004，122（2）：131-139.

［11］ Segura MM，Garnier A，Durocher Y，et al.Production of lentiviral vectors by large-scale transient transfection of suspension cultures and affinity chromatography purification［J］.Biotechnol Bioeng，2007，98（4）：789-799.

［12］Reed SE，Staley EM，Mayginnes JP，et al.Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors［J］.J Virol Methods，2006，138（1-2）：85-98.

［13］ Geraerts M，Michiels M，Baekelandt V，et al.Upscaling of lentiviral vector production by tangential flow filtration［J］.J Gene Med，2005，7（10）：1299-1310.

［14］ Pham PL，Kamen A，Durocher Y.Large-scale transfection of mammalian cells for the fast production of recombinant protein［J］.Mol Biotechnol，2006，34（2）：225-237.

［15］Derouazi M，Girard P，Van Tilborgh F，et al.Serum-free large-scale transient transfection of CHO cells［J］.Biotechnol Bioeng，2004，87（4）：537-545.

［16］Thomas M，Ge Q，Lu JJ，et al.Cross-linked small polyethylenimines：while still nontoxic，deliver DNA efficiently to mammalian cells in vitro and in vivo［J］.Pharm Res，2005，22（3）：373-380.

［17］Kuroda H，Kutner RH，Bazan NG，et al.Simplified lentivirus vector production in protein-free media using polyethylenimine-mediated transfection［J］.J Virol Methods，2009，157（2）113-121.

［18］ Sun X，Hia HC，Goh PE，et al.High-density transient gene expression in suspension-adapted 293 EBNA1 cells［J］.Biotechnol Bioeng，2008，99（1）：108-116.

［19］Toledo JR，Prieto Y，Oramas N，et al.Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors［J］.Appl Biochem Biotechnol，2009，157（3），538-544.

［20］ Pham PL，Perret S，Cass B，et al.Transient gene expression in HEK293 cells：peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis［J］.Biotechnol Bioeng，2005，90（3）：332-344.

［21］ Barde I，Salmon P，Trono D.Production and titration of lentiviral vectors［J］.Curr Protoc Neurosci，2010，4：21.

［22］Geraerts M，Willems S，Baekelandt V，et al.Comparison of lentiviral vector titration methods［J］.BMC Biotechnol，2006，6：34.

［23］ Kutner RH，Puthli S，Marino MP，et al.Simplified production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors using HYPERFlask vessels and anion exchange membrane chromatography［J］.BMC Biotechnol，2009，9：10.

［24］Reiser J.Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors［J］.Gene Ther，2000，7（11）：910-913.

［25］Sakoda T，Kasahara N，Kedes L，et al.Calcium phosphate coprecipitation greatly enhances transduction of cardiac myocytes and vascular smooth muscle cells by lentivirus vectors［J］.Exp Clin Cardiol，2007，12（3）：133-138.

［26］Cartier N，Hacein-Bey-Abina S，Bartholomae CC，et al.Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy［J］.Science，2009，326（5954）：818-823.

［27］ Chen C，Akerstrom V，Baus J，et al.Comparative analysis of the transduction efficiency of five adeno associated virus serotypes and VSV-G pseudotype lentiviral vector in lung cancer cells［J］.Virol J，2013，14：1086.

［28］Gambari R.Alternative options for DNA-based experimental therapy of β-thalassemia［J］.Expert Opin Biol Ther，2012，12（4）：443-462.

［29］Allen PJ，F(xiàn)eigin A.Gene-based therapies in Parkinson's disease［J］. Neurotherapeutics，2014，11（1）：60-67.

［30］Dullaers M，Van Meirvenne S，Heirman C，et al.Induction of effective therapeutic antitumor immunity by direct in vivo administration of lentiviral vectors［J］.Gene Ther，2006，13（7）：630-640.

［2014-07-19收稿］［2014-08-28修回］［編輯 游雪梅］

Q782

A

1674-5671（2014）03-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.03.19

國家自然科學基金資助項目（81360341）；廣西自然科學基金資助項目（2011GXNSFC018020,2012GXNSFAA053163）；廣西醫(yī)療衛(wèi)生適宜技術(shù)研究與開發(fā)課題（S201301-06）

王琪。E-mail：qi_catcat@163.com

△梁霞為共同第一作者。