■程志斌 姜自琴 廖國(guó)周 樊月圓 王桂瑛 蘇子峰 畢保良 潘洪彬 汪 霞 黃 偉

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650031；3.大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理671003）

自從Sanguansermsri等(1974)在人奶和牛奶中發(fā)現(xiàn)腐胺、亞精胺和精胺這三種多胺活性分子后(Kazuei等，2010)，營(yíng)養(yǎng)學(xué)家對(duì)精胺等多胺類活性分子對(duì)腸道發(fā)育的影響產(chǎn)生了濃厚興趣。大量研究證明，精胺是多胺的一種，存在于所有真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中，精胺在細(xì)胞的增殖、增生和分化等生物過(guò)程中有重要的生理作用，尤其是對(duì)小腸黏膜上皮細(xì)胞等快速增殖和分化的組織細(xì)胞（Tabor等，1984）。已有試驗(yàn)證明，豬乳中同樣含有豐富的精胺（程志斌等，2010），同時(shí)哺乳仔豬和剛斷奶仔豬腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)精胺含量隨日齡增加而持續(xù)升高（Wu等，2000）。以上這些報(bào)告提示，精胺可能是哺乳仔豬腸道發(fā)育和成熟的必需活性因子之一?；谶@個(gè)假設(shè)，本試驗(yàn)對(duì)幼齡哺乳仔豬進(jìn)行口服精胺試驗(yàn)，設(shè)置不同精胺劑量，測(cè)定精胺對(duì)小腸重量、長(zhǎng)度、絨毛高度和隱窩深度等指標(biāo)，從形態(tài)學(xué)角度探討口服精胺對(duì)豬腸道發(fā)育和成熟的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)日糧

試驗(yàn)選取6頭“長(zhǎng)白×大白”妊娠母豬所產(chǎn)的6窩仔豬進(jìn)行試驗(yàn)。仔豬出生后6 h，每頭母豬窩仔數(shù)統(tǒng)一為10頭。0 d定義為第一頭仔豬出生日，仔豬0～10 d維持正常的哺乳。哺乳11 d的早晨07:00～07:30開(kāi)始試驗(yàn)。所有6窩仔豬逐頭稱重并記錄體重，隨后每窩選取6頭體重最相近、健康狀況良好的仔豬[初始體重(3.50±0.11)kg]，共36頭進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，以窩別為區(qū)組，每頭仔豬為試驗(yàn)重復(fù)和單元，精胺每日口服劑量為處理，同窩選取的6頭仔豬隨機(jī)分配到一個(gè)精胺劑量處理組，6個(gè)處理組精胺劑量分別設(shè)置為：0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/kg BW。母豬的哺乳日糧按照NRC（1998）營(yíng)養(yǎng)推薦量配制玉米-豆粕型粉料，日糧配方和營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 日糧配方和營(yíng)養(yǎng)水平

1.2 精胺溶液

精胺為Sigma公司（美國(guó)）產(chǎn)品，口服精胺溶液由0.9%生理鹽水配制成濃度50 μmol/l，處理1組以口服生理鹽水替代。

1.3 飼養(yǎng)管理

哺乳母豬采用單欄飼喂管理，欄圈面積1.5×2.1 m2，乳頭式飲水器自由飲水，哺乳日糧不限飼，飼喂時(shí)間為每日08:00和17:00。產(chǎn)仔舍的溫度控制在(22±2)℃，仔豬保溫箱通過(guò)加熱燈維持溫度(32±2)℃，產(chǎn)仔舍保持24 h光照。專門飼養(yǎng)員管理母豬采食情況，母豬采食后，剩余在料槽和拋灑在地面的飼料立即清除干凈，以防止仔豬采食。同時(shí)，哺乳全期所有仔豬不提供補(bǔ)料。在3 d的試驗(yàn)期中，試驗(yàn)仔豬和母豬健康狀況良好。

1.4 試驗(yàn)過(guò)程

哺乳11～13 d，口服精胺每天1次。每次口服精胺結(jié)束后，試驗(yàn)仔豬與其它4頭仔豬仍由母豬維持正常哺乳。試驗(yàn)選取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/kg BW這6個(gè)精胺劑量的原因是，幾次預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，精胺劑量低于0.1 mmol/kg BW對(duì)仔豬腸道的發(fā)育沒(méi)有顯著影響。第14 d的早晨8:00，36頭試驗(yàn)仔豬頸靜脈放血致死。仔豬小腸被完整取出，在冰盒冷卻的鐵板上仔細(xì)迅速去除腸系膜后，立即測(cè)定小腸的長(zhǎng)度和重量。

為測(cè)定小腸黏膜重量，分別截取十二指腸、空腸和回腸各約10 cm。十二指腸的取樣部位從十二指腸的胰管開(kāi)口處到Treitz結(jié)；空腸從小腸中點(diǎn)約50%處采樣；回腸從小腸后端約25 cm處到回盲口。所取樣品用4℃生理鹽水沖洗，剖開(kāi)腸管，用潔凈的干紗布蘸干水分，用雙面玻璃刀片仔細(xì)完全的刮取腸黏膜，并測(cè)定黏膜重量，黏膜重量單位表示為g/10 cm。為了分析腸道絨毛高度和隱窩深度，分別截取十二指腸、空腸和回腸各約2 cm。十二指腸的取樣部位在十二指腸的胰管開(kāi)口處前端2 cm；空腸從小腸中點(diǎn)約50%處采樣；回腸的取樣部位在回盲口前端2 cm。所有樣品立即轉(zhuǎn)入10%甲醛固定液。

1.5 腸道形態(tài)學(xué)測(cè)定

絨毛高度和隱窩深度按照Wu等（1996）的方法進(jìn)行測(cè)定。將固定液中樣品取出，修剪成1 cm3大小的樣品塊。樣品在二甲苯中漂洗，并用石蠟包埋。每個(gè)包埋好的樣品切割出4個(gè)5 μm厚的切片，用“蘇木紅－尹紅”染色。切片在尼康雙筒目鏡(Warsaw公司，波蘭)下測(cè)定絨毛高度和隱窩深度，放大倍數(shù)20。腸絨毛高度是從隱窩開(kāi)口至絨毛頂端的距離，隱窩深度是基底層至隱窩開(kāi)口的距離。對(duì)于所有腸道形態(tài)學(xué)測(cè)定指標(biāo)，每張切片至少觀察測(cè)定20根完整、長(zhǎng)且直的絨毛及其相應(yīng)的隱窩。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析以精胺的劑量為主效應(yīng)，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Student-Newman-Keuls多重比較，統(tǒng)計(jì)顯著性表示為P＜0.05。對(duì)產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)顯著性的指標(biāo)進(jìn)一步進(jìn)行一次線性和二次曲線正交分析，以P＜0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量精胺對(duì)哺乳仔豬小腸生長(zhǎng)發(fā)育的影響（見(jiàn)表2）

表2 不同劑量精胺對(duì)哺乳仔豬小腸重量和長(zhǎng)度的影響

由表2可知，通過(guò)一次線性正交統(tǒng)計(jì)分析顯示：隨著精胺劑量的增加，小腸重量、十二指腸黏膜及空腸黏膜重量顯著增加。進(jìn)一步通過(guò)多重比較分析顯示：增加小腸重量、十二指腸黏膜及空腸黏膜重量的精胺劑量是0.4～0.5 mmol/kg BW。

2.2 不同劑量精胺對(duì)哺乳仔豬十二指腸、空腸和回腸絨毛高度和隱窩深度的影響

十二指腸測(cè)定結(jié)果顯示（圖1，A）：精胺0～0.5 mmol/kg BW處理組絨毛高度分別為575、583、569、543、507、495 μm，隱窩深度分別為177、170、183、181、196、192 μm，隨著精胺劑量增加，提高了仔豬十二指腸隱窩深度(P＜0.05)，降低了絨毛高度(P＜0.05)?？漳c測(cè)定結(jié)果顯示(圖1，B)：精胺0～0.5 mmol/kg BW處理組絨毛高度分別為734、725、713、651、612、593 μm，隱窩深度分別為152、159、165、172、178、181 μm，隨著精胺劑量增加，提高了仔豬空腸隱窩深度（P＜0.01），降低了絨毛高度（P＜0.01）。進(jìn)一步通過(guò)多重比較分析顯示：改變十二指腸及空腸絨毛形態(tài)的精胺劑量是0.4～0.5 mmol/kg BW。相對(duì)而言，回腸絨毛高度和隱窩深度在各精胺處理組間差異不顯著（圖1，C）。

圖1 不同劑量精胺對(duì)哺乳仔豬小腸絨毛高度和隱窩深度的影響

3 討論

表2試驗(yàn)結(jié)果顯示，11日齡哺乳仔豬口服精胺0.4～0.5 mmol/kg BW，持續(xù)3 d，小腸重量以及十二指腸和空腸黏膜重量顯著增加。由于精胺對(duì)小腸長(zhǎng)度沒(méi)有影響，顯然仔豬小腸重量增加是由于精胺增加了小腸黏膜重量。這一結(jié)果與口服精胺增加幼齡哺乳大鼠小腸重量和小腸黏膜重量的試驗(yàn)結(jié)果一致（Ka?ouass等，1994）。小腸上皮細(xì)胞是小腸黏膜組成的基本單位，口服精胺增加小腸黏膜重量暗示精胺促進(jìn)了小腸黏膜上皮細(xì)胞增殖和（或）增生。

小腸黏膜上皮細(xì)胞來(lái)源于小腸隱窩處的干細(xì)胞（stem cell）。隱窩干細(xì)胞是隱窩唯一具有分裂和增殖功能的細(xì)胞，隱窩干細(xì)胞分化形成的腸上皮細(xì)胞，從小腸隱窩逐步向絨毛頂端遷移。小腸上皮細(xì)胞在遷移過(guò)程中逐步完成功能的成熟，這些功能包括正常的消化、吸收和分泌等功能（Yen，2001）。因此，小腸絨毛高度可以作為小腸黏膜上皮細(xì)胞功能發(fā)育的標(biāo)志，而隱窩深度則顯示隱窩上皮細(xì)胞的增殖狀況。小腸絨毛高度和隱窩深度這兩個(gè)形態(tài)學(xué)指標(biāo)，作為仔豬腸道發(fā)育和成熟的主要標(biāo)志之一，已經(jīng)被廣泛研究和采納（Crea等，1988；Cranwell，1994）。Crea等（1988）用掃描電鏡觀測(cè)了0～35日齡哺乳仔豬空腸絨毛的形態(tài)變化，試驗(yàn)結(jié)果顯示，剛出生仔豬空腸絨毛高度較大，隨后在哺乳2～5周齡絨毛高度迅速降低。Cranwell（1995）也證實(shí)，仔豬出生前10 d腸絨毛高度有增加的趨勢(shì)，10 d后絨毛高度降低。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著精胺口服劑量的增加，仔豬十二指腸和空腸絨毛高度降低，而隱窩深度持續(xù)增加，梯度增加口服精胺劑量對(duì)11～14日齡哺乳仔豬腸道絨毛高度和隱窩深度的影響，與2～4周更大日齡的哺乳仔豬腸道發(fā)育形態(tài)學(xué)變化過(guò)程十分相似。這說(shuō)明口服精胺促進(jìn)了幼齡哺乳仔豬小腸形態(tài)發(fā)育與成熟，腸道形態(tài)的提前發(fā)育成熟有利于幼齡仔豬更好適應(yīng)斷奶應(yīng)激。

口服精胺誘導(dǎo)了哺乳仔豬絨毛高度降低和隱窩深度提高，這一結(jié)果與口服精胺誘導(dǎo)大鼠腸道形態(tài)學(xué)的變化結(jié)果一致（Buts等，1993；Kaouass等，1994）。精胺誘導(dǎo)哺乳仔豬絨毛高度降低和隱窩深度提高的作用機(jī)理可能與上皮細(xì)胞周轉(zhuǎn)和隱窩細(xì)胞增殖有關(guān)（Peulen等，2000）。Peulen等（2000）綜述了精胺誘導(dǎo)小腸形態(tài)學(xué)變化的機(jī)理。這個(gè)機(jī)理包括兩個(gè)連續(xù)的生理過(guò)程：第一，外源（口服途徑）精胺進(jìn)入腸道的4 h內(nèi)被腸道上皮細(xì)胞攝入，進(jìn)入上皮細(xì)胞并貯存。由于上皮細(xì)胞內(nèi)精胺濃度迅速增加，誘導(dǎo)了上皮細(xì)胞的凋亡（apopto?sis），因此導(dǎo)致口服精胺后腸絨毛高度瞬時(shí)降低。第二，口服精胺10～48 h后，隱窩干細(xì)胞加速分裂增殖，分化出的新上皮細(xì)胞由隱窩逐漸向腸絨毛頂端遷移，以彌補(bǔ)精胺誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞凋亡而引起的腸絨毛上皮細(xì)胞損失。因此，口服精胺48 h后，小腸絨毛高度逐步增加，但不能恢復(fù)到口服前的水平。小腸黏膜形態(tài)學(xué)變化與黏膜蛋白質(zhì)、DNA和RNA含量以及二糖酶比活力等理化指標(biāo)的變化同步（Sabater-Molina等，2009）。

相對(duì)而言，各個(gè)精胺處理組間回腸絨毛高度和隱窩深度都差異不顯著（圖1），這與口服精胺沒(méi)有顯著影響回腸黏膜重量的結(jié)果相符（表2），這些結(jié)果都說(shuō)明，本試驗(yàn)條件下口服精胺沒(méi)有顯著改善回腸上皮細(xì)胞功能，對(duì)回腸的發(fā)育沒(méi)有促進(jìn)效應(yīng)。對(duì)于口服精胺可以促進(jìn)小腸前端和中段腸道發(fā)育，但對(duì)末端小腸發(fā)育沒(méi)有顯著效果的這一結(jié)果，有待于進(jìn)一步試驗(yàn)探討。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，幼齡哺乳仔豬（11日齡）口服精胺，顯著增加了十二指腸和空腸黏膜重量，降低絨毛高度，提高隱窩深度。從形態(tài)學(xué)角度證明，口服精胺誘導(dǎo)了幼齡哺乳仔豬小腸的發(fā)育和成熟，且在本試驗(yàn)條件下精胺發(fā)揮作用的起始劑量是0.4～0.5 mmol/kg BW。