劉美蘭 ，譚曉風 ，龍洪旭 ，王 哲 ，劉 璐 ，王僳僳

(1.中南林業(yè)科技大學 經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004；2.泰安市林業(yè)局，山東 泰安 271000；3.咸安區(qū)林業(yè)局林業(yè)調(diào)查規(guī)劃設計院，湖北 咸寧 437000)

油桐Vernicia fordii是世界著名的工業(yè)油料樹種，也是我國四大木本油料植物(油桐、油茶、核桃、烏桕)之一。桐油是一種具有很高經(jīng)濟價值的工業(yè)油料和原料，是油漆、油墨、生物柴油等產(chǎn)品的生產(chǎn)原料[1]。桐油是由多種脂肪酸(如桐酸、亞油酸、亞麻酸等)混合而成的，而這些脂肪酸的合成又是通過油桐內(nèi)脂肪酸合成代謝過程完成的[2-5]。因此，了解油桐內(nèi)參與脂肪酸合成的相關酶對于分子改良桐油性質(zhì)有著非常重要的意義。

丙二酰單酰CoA:ACP轉(zhuǎn)?；?Malonyl CoA:ACP transacylase，MCAT)是脂肪酸生物合成途徑的關鍵酶，它是由mcat基因編碼的一種巰基酶，在Ⅱ型脂肪酸合成途徑中起著極其重要的作用，負責在起始步驟把丙二?；鶊F從丙二酰單酰CoA上的硫酯連接部位轉(zhuǎn)移到ACP的磷酸泛酰巰基乙胺臂上而形成丙二酰單酰ACP，即脂肪酸生物合成過程中的延伸底物，是從頭合成脂肪酸的關鍵構(gòu)件[6-10]。目前，玉米中MCAT基因是直接通過基因功能互補的方法篩選出來的，Verwoert等人將玉米的cDNA文庫轉(zhuǎn)化到大腸桿菌fabD突變體中，篩選轉(zhuǎn)化后代的遺傳表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一個編碼GTP結(jié)合蛋白的基因可以互補fabD的表型，并通過進一步的實驗確認了該基因即玉米的MCAT基因[11]。利用玉米的MCAT制作探針篩選油菜的cDNA文庫，得到了油菜中MCAT基因，將此基因在大腸桿菌fabD突變體中表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它能恢復MCAT基因的生物活性，這一結(jié)果證明它具有MCAT的功能[12]。大豆中的MCAT基因至少有兩種等位酶形式，雖其生化性質(zhì)有所不同，但都能催化轉(zhuǎn)酰基反應，其中MCAT1主要在種子中表達，而在葉子中兩種形式都存在[13]。有關油桐中MCAT基因的研究迄今未見有報道，因此本研究以油桐為試材，克隆獲得了油桐MCAT基因序列，并對其生物學功能進行了預測分析，以期為下一步驗證MCAT基因在油桐脂肪酸合成代謝中的功能奠定基礎，同時為油桐分子育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

供試葡萄桐栽培于湖南省永順縣青坪鎮(zhèn)中南林業(yè)科技大學油桐試驗基地，于2012年采集成熟種子，經(jīng)液氮處理后保存于-80℃的冰箱內(nèi)。

主要試劑：RNA提取試劑盒購自invitrogen，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；PrimeSTAR HS DNA Polymerase高保真DNA聚合酶購自Takara；2×EasyTaq PCR SuperMix、pEASY-Blunt Simple Cloning Kit、大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細胞均購自全式金公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根公司；引物合成及測序分別由華大基因和博尚生物公司完成；其他試劑均為分析純。

1.2 研究方法

1.2.1 RNA 的抽提與cDNA 第一鏈的合成

油桐種子總RNA是采用試劑盒＋CTAB方法[14]抽提的，取2μL 的總RNA，用1％ 的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，最后用紫外分光光度計定量測定和純度分析抽提效果。選擇一定濃度且高純度的總RNA樣品，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟合成油桐cDNA 第一鏈，貯存于-20℃的冰箱內(nèi)。

1.2.2 油桐MCAT基因的特異引物設計和片段擴增

設計引物序列來源于本實驗室油桐種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[15]，利用Primer Premier 5.0軟件設計MCAT的上下游引物，其分別是MCAT-F(5'GCTCCGCTAACCTACTCAGT3')和MCAT-R(5' GCTGTCTATCTTGGATTGAACA 3')。以油桐cDNA為模板，用高保真酶進行PCR擴增，反應體系和程序見說明書。用瓊脂糖凝膠檢測并回收目的片段，將目的片段連入pEASY-Blunt Simple載體和轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞中，篩選陽性克隆并測序。

1.2.3 油桐MCAT基因的生物信息學分析

利用在線NCBI-ORF Finder和本地軟件DNAMAN進行開放閱讀框(Open reading frame，ORF)的查找和翻譯；在線 NCBIblastp進行同源搜索并下載序列，利用本地軟件GeneDoc和MEGA5.1進行同源比對和構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；利用ProtParam 在線工具分析油桐MCAT基因編碼蛋白的氨基酸組成及其理化性質(zhì)；采用在線工具ProtScale、TMpred對其編碼蛋白的疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)和跨膜區(qū)拓撲結(jié)構(gòu)進行預測；利用在線工具SOPMA 和SWISS-MODE對其二維結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)分別進行預測，并利用本地軟件UCSF Chimera對其三維結(jié)構(gòu)進行分析；最后利用在線PSORTⅡ預測MCAT的亞細胞位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 油桐MCAT基因的克隆與序列分析

根據(jù)本實驗室收集的油桐不同時期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析[15]，利用本地軟件Premier 5設計特異引物，以油桐種子cDNA為模板，克隆并測序，獲得了一條長為1 488bp的片段(如圖1A)。采用在線NCBI的ORFFinder程序，參照Kozak法則[16]，尋找出一條長為1 179bp的ORF(如圖1B)，編碼392個氨基酸。ORF的識別是證明一個新的DNA序列為特定的蛋白質(zhì)編碼基因的部分或全部的先決條件。因此可初步判斷，獲得的序列為油桐中一個新基因的cDNA序列。

圖1 油桐MCAT的RT-PCR擴增產(chǎn)物和ORF分析結(jié)果Fig.1 The result of RT-PCR ampli fi cation and ORF analysis of VfMCAT gene

2.2 油桐MCAT蛋白的同源性和系統(tǒng)進化樹分析

利用本地軟件GeneDoc將找出的ORF序列翻譯成氨基酸序列，然后利用在線NCBIblastp將序列進行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本次實驗獲得的序列與蓖麻和亞麻的MCAT的同源性均達到85％。將獲得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知的各樹種的MCAT進行同源性比對，結(jié)果(如圖2)發(fā)現(xiàn)，獲得的蛋白質(zhì)序列與各樹種的MCAT都有較高的同源性，各物種MCAT所編碼的氨基酸都存在“GXSXG”和“GQGXQ”這兩個高度保守的motif，且各樹種MCAT的C端序列的保守性特別強(如圖2中的黑色部分所示)，而N端前100 aa序列的特異性則特別強。利用本地軟件MEGA5.1中的Construct/Test Neighbor-Joining Tree將NCBIblast的搜索結(jié)果生成進化樹，結(jié)果(如圖3)表明，獲得的序列與蓖麻和亞麻的MCAT的親緣關系最近。綜合上述結(jié)果可以判斷，本實驗獲得的片段確為油桐MCAT基因片段。

2.3 油桐MCAT編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)包括其氨基酸組成、相對分子質(zhì)量、原子組成和等電點等[17]。采用在線軟件ProtParam和本地軟件DNAMAN對油桐MCAT編碼蛋白的理化性質(zhì)進行了分析，結(jié)果表明：油桐MCAT編碼392個氨基酸，氨基酸的組成如圖4，其中最多的為Ala(丙氨酸)，占11.7％；其負電荷殘基總數(shù)(Asp＋Glu)為40，正電荷殘基總數(shù)(Arg＋Lys)為43；該蛋白的分子式為C1834H2972N504O569S15，分子量約為41.67 Kda；其理論等電點pI為8.43，不穩(wěn)定系數(shù)為34.9，說明它是一種穩(wěn)定蛋白。

2.4 油桐MCAT編碼蛋白的疏水性或親水性和跨膜結(jié)構(gòu)的預測與分析

利用在線軟件ProtScale分析油桐MCAT編碼蛋白的疏水性或親水性，所得圖譜如圖5A。由圖5A可知，多肽鏈的第223位的絲氨酸(Ser)具有最高的分值2.089，說明其疏水性最強；第48位的天冬酰胺(Asn)具有最低分值-2.111，說明其親水性最強，親水殘基多于疏水殘基，且疏水殘基與親水殘基均分布在整條多肽上，整條多肽上都表現(xiàn)出親水性。利用在線軟件TMPred進行分析，結(jié)果表明，油桐MCAT編碼蛋白存在一個跨膜結(jié)構(gòu)域，可能的位置是第284～302的19個氨基酸位置。因此可以推斷，油桐MCAT是含有一個跨膜結(jié)構(gòu)的可溶性蛋白。

2.5 油桐MCAT編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)的預測分析

用SOPMA預測油桐MCAT編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖6所示，α- 螺旋和無規(guī)則卷曲是油桐MCAT最大量的結(jié)構(gòu)元件，而β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈則散布于整個蛋白質(zhì)中。統(tǒng)計結(jié)果表明，油桐MCAT編碼蛋白由41.84％的α-螺旋(Alpha helix)、28.57％的無規(guī)則卷曲(Random coil)、20.66％的延伸鏈(Extended strand)、8.93％的β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)構(gòu)成。采用SWISS-MODE和UCSF Chimera軟件對MCAT編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)進行預測和分析，結(jié)果(如圖7A和B)發(fā)現(xiàn)，其二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)一致。

圖2 油桐MCAT與其它植物MCAT的氨基酸序列的比對結(jié)果Fig.2 Alignment of deduced amino acid sequences of VfMCAT and MCAT from other plants

2.6 油桐MCAT編碼蛋白的亞細胞定位分析

亞細胞定位的預測一般通過算法比較查詢序列中所包含的特征參數(shù)與各類相應的亞細胞定位的相似度，然后以一組概率值的形式作出判斷。借助工具WoLF PSORT預測MCAT編碼蛋白的亞細胞定位，分析結(jié)果表明，該蛋白最有可能在葉綠體基質(zhì)中發(fā)揮作用。

3 結(jié)論與討論

圖3 不同物種MCAT基因的系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果Fig.3 Phylogenetic tree analysis of MCAT from different species

圖4 油桐MCAT的氨基酸組成Fig.4 The amino acid compositions of VfMCAT

圖5 油桐MCAT蛋白的疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)的預測結(jié)果Fig.5 The predicted hydrophilicity pro fi le and transmembrane domains of VfMCAT

在Ⅱ型脂肪酸的合成代謝中，丙二酰單酰CoA:ACP轉(zhuǎn)?；傅拇呋a(chǎn)物丙二酰單酰ACP是脂肪酸代謝過程中的核心物質(zhì)，是酮酯酰ACP合成酶(KASI/II/Ш)進行脂肪酸鏈延伸進一步合成脂肪酸的底物，因此丙二酰單酰CoA:ACP轉(zhuǎn)?；甘强刂浦舅崮芊駨念^合成的關鍵酶[6-7]。同源性比對和進化樹構(gòu)建結(jié)果表明，油桐MCAT與蓖麻、亞麻的MCAT的同源性最高都為85％，且它們之間的分子進化距離最近，其親緣關系最為密切。各物種MCAT所編碼的氨基酸都存在“GXSXG”和“GQGXQ”這兩個高度保守的motif；結(jié)構(gòu)信息分析結(jié)果也證實這兩個motif與MCAT的功能密切相關[7,18-19]。同源性是在一定程度上代表著物種之間功能的相似性和親緣關系的遠近，同時也反映了MCAT編碼產(chǎn)物在不同物種結(jié)構(gòu)上的穩(wěn)定性與對生物體的功能重要性[20]。所以可以確定，本研究獲得的序列為油桐MCAT基因序列，且各物種間MCAT的C端都特別保守，這可能是各物種MCAT具有相似功能的原因。分析該蛋白后發(fā)現(xiàn)，油桐MCAT編碼392個氨基酸，平均疏水系數(shù)為-0.031，整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性，說明其為水溶性蛋白，其二級結(jié)構(gòu)很容易接近水分子，油桐MCAT編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋和無規(guī)則卷曲。對其蛋白質(zhì)的亞細胞定位、疏水或親水性和跨膜結(jié)構(gòu)的分析與預測結(jié)果表明，油桐MCAT是一種含有一個跨膜結(jié)構(gòu)的水溶性蛋白，而且主要是在線粒體內(nèi)發(fā)揮作用。植物MCAT是Ⅱ型脂肪酸的合成代謝中的關鍵酶，主要發(fā)生在葉綠體內(nèi)[21]，由此可以判斷，油桐MCAT是在線粒體中參與油桐內(nèi)脂肪酸合成代謝的。

油桐是我國四大木本油料樹種之一，桐油中的脂肪酸種類較多，目前對桐油的脂肪酸合成過程尚不清楚，以往對油桐的研究主要集中在良種選育等方面，而對桐油脂肪酸合成的分子機理的研究報道則相對較少。本研究克隆獲得了與油桐油脂合成相關的MCAT基因，并對其生物學功能進行了預測，這為進一步研究和探討該基因的功能奠定了基礎，也為研究油桐脂肪酸合成代謝提供了理論依據(jù)。

圖6 油桐MCAT蛋白二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果Fig.6 The predicted secondary structure of VfMCAT

圖7 油桐MCAT蛋白三級結(jié)構(gòu)模型預測結(jié)果Fig.7 The predicted tertiary structure of VfMCAT

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