孫晶，楊洪一，隋春

(1.東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193； 3.中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

綜 述

不同因子對(duì)藥用植物毛狀根產(chǎn)量和次生代謝產(chǎn)物積累影響的研究進(jìn)展△

孫晶1，2，楊洪一1，隋春2，3*

(1.東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193； 3.中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

以根為藥用部位的藥材占中藥材種類的30%左右。毛狀根培養(yǎng)體系是藥用植物生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的新途徑、新方法。影響毛狀根生長(zhǎng)及其次生代謝物形成的因素有很多，如：物理因素、化學(xué)因素、前體物的添加、誘導(dǎo)子等。通過(guò)優(yōu)化毛狀根培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基配比，可提高毛狀根和次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。本文就藥用植物毛狀根誘導(dǎo)形成及大規(guī)模生產(chǎn)中的根產(chǎn)量和次生代謝產(chǎn)物積累的影響因素與作用機(jī)理做一綜述，為相關(guān)研究和應(yīng)用提供參考。

毛狀根，次生代謝產(chǎn)物，因素

毛狀根培養(yǎng)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的基因工程和細(xì)胞工程相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù)，通過(guò)將發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacteriumrhizogenes中Ri質(zhì)粒含有的T-DNA整合到植物細(xì)胞的DNA上，誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生毛狀根[1]。相對(duì)于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)，毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)具有生長(zhǎng)快速、無(wú)需外源植物激素、合成次生代謝物質(zhì)能力強(qiáng)而且穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件，毛狀根甚至可以合成比原植物中高出數(shù)倍的活性物質(zhì)，或原植物不合成的活性成分[2]。由于毛狀根體系在生物量增加和生物有效成分積累方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)越性，使得利用毛狀根生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物具有很大潛力。因此人們對(duì)其應(yīng)用于藥物生產(chǎn)進(jìn)行了探究和開(kāi)發(fā)。目前，應(yīng)用毛狀根培養(yǎng)技術(shù)已成功誘導(dǎo)出南非醉茄WithaniaSomnifera[3]、丹參Salviamiltiorrhiza[4-5]、短小蛇根草Ophiorrhizapumila[6]、人參Panaxginseng[7]、青蒿Artemisiaannua[8]和黃芩Scutellariabaicalensis[9]等26科96種[10]藥用植物的毛狀根。人參皂苷、黃酮類[11-12]等也已通過(guò)毛狀根培養(yǎng)體系得以工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。

實(shí)現(xiàn)藥用植物毛狀根大規(guī)模培養(yǎng)的前提是低成本、高產(chǎn)出。通常需要在一定培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)盡可能提高有效藥用成分積累量。藥用成分積累量包括兩方面內(nèi)容：一是要提高毛狀根的產(chǎn)量，二是要增加目標(biāo)產(chǎn)物含量比率。目前藥用廣泛的植物代謝產(chǎn)物包括生物堿類、皂苷類、黃酮類、醌類，以及蛋白質(zhì)和一些重要的生物酶[2,13-14]，其中既有初生代謝產(chǎn)物，又有次生代謝產(chǎn)物。通常毛狀根產(chǎn)量的提高與目標(biāo)產(chǎn)物含量比率的提高存在矛盾。有效權(quán)衡多方面影響因素才能達(dá)到理想的效果[15]。毛狀根誘導(dǎo)條件研究進(jìn)展有多篇綜述報(bào)道[3,7,10,13,16]，本文對(duì)影響毛狀根生長(zhǎng)及其次生代謝物積累的各種理化因子以及毛狀根大規(guī)模生產(chǎn)條件的研究做一綜述。

1 物理因素

影響毛狀根生長(zhǎng)與次生代謝物質(zhì)積累的物理因素有：光照、pH、溶氧狀況、接種量和溫度等[17]，藥用植物毛狀根工業(yè)化生產(chǎn)中，有效調(diào)控這些物理因素，針對(duì)不同植物摸索出具體培養(yǎng)條件，對(duì)毛狀根生產(chǎn)意義重大，可以有效增加毛狀根生物量和次生代謝產(chǎn)物積累量[18]。

1.1 光照

光照對(duì)誘導(dǎo)分化通常是必要的，可激活某些酶的活性以及光誘導(dǎo)的葉綠體或葉綠體代謝產(chǎn)物的存在[15]。光照對(duì)毛狀根的生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物積累具有一定的作用效果。楊睿等[19]研究表明，光強(qiáng)為3 500 lx，光周期為18 h·d-1時(shí)，雪蓮毛狀根生長(zhǎng)量達(dá)到12.4 g·L-1(DW)，是全黑暗時(shí)的2.1倍，是全光照時(shí)的1.2倍；總黃酮合成量為1 179 mg·L-1，比全黑暗時(shí)提高了160%，比全光照時(shí)提高了20%。然而，對(duì)不同的植物而言，選擇吸收的光源和光照強(qiáng)度等是需要摸索的條件，不同的植物存在一定差異。如歐紹云等[17]研究表明，黑暗培養(yǎng)的南美蟛蜞菊毛狀根顏色淺白，根較纖細(xì)，分枝較多，而光照培養(yǎng)的毛狀根顏色呈墨綠色，明顯老化，根較粗壯但分枝較少，并且暗培養(yǎng)毛狀根的生物量增長(zhǎng)倍數(shù)約是光照培養(yǎng)的1.3倍，表明暗培養(yǎng)對(duì)南美蟛蜞菊毛狀根的生長(zhǎng)較為有利。Yu等[20]通過(guò)研究人參毛狀根在暗培養(yǎng)、熒光燈光、金屬鹵素?zé)艄?、紅光、藍(lán)光、紅加藍(lán)發(fā)光二極管燈光等6種光照條件下毛狀根生長(zhǎng)和人參皂苷積累的情況，表明：人參毛狀根液體培養(yǎng)分為兩個(gè)階段，第一階段毛狀根在黑暗條件下培養(yǎng)，這有利于人參毛狀根產(chǎn)量的增加，第二階段轉(zhuǎn)入熒光燈下培養(yǎng)，這有利于人參皂苷含量的積累。同時(shí)，光照對(duì)于提高毛狀根生物量和增加次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累所要求的條件是不相一致的，因此我們應(yīng)該綜合考慮這兩方面的因素，找到合適光照條件。

1.2 pH

pH的變化會(huì)引起培養(yǎng)基成分狀態(tài)的改變，多數(shù)毛狀根生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物合成適合偏酸[21]性環(huán)境，一般培養(yǎng)的最適pH為5.0～6.0。如王淑芳等[22]研究發(fā)現(xiàn)，粘毛黃芩毛狀根的最適生長(zhǎng)pH為5.8，但最適黃酮類化合物的合成是在pH為6.4。許鐵峰等[23]研究表明，1/2 MS培養(yǎng)液pH在5.4～5.8最適合粟米草毛狀根的生長(zhǎng)。人們通過(guò)研究pH對(duì)多種藥用植物毛狀根培養(yǎng)的影響，表明pH過(guò)高或過(guò)低都不利于毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的積累。李博華等[24]研究了四倍體菘藍(lán)毛狀根在不同pH(4.6、5、5.4、5.8、6.2、6.6、7.0、7.4)的1/2 MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)毛狀根，結(jié)果表明，當(dāng)pH為5.8時(shí)，毛狀根生長(zhǎng)量達(dá)到最大，當(dāng)pH大于或小于5.8時(shí)，毛狀根生長(zhǎng)量均不同程度減少。

毛狀根培養(yǎng)液中適宜的溶氧量對(duì)毛狀根的生長(zhǎng)和代謝具有顯著的影響作用。適宜的溶氧量可以促進(jìn)毛狀根的生長(zhǎng)。培養(yǎng)液的溶氧量一般是通過(guò)毛狀根培養(yǎng)搖瓶的體積和搖瓶中裝液量的多少控制，如在一定體積搖瓶中，裝液量越少，培養(yǎng)液中溶氧越高。蘆韋華等[25]研究發(fā)現(xiàn)將新疆紫草毛狀根接種在SH培養(yǎng)液中，通過(guò)培養(yǎng)容積的逐級(jí)放大和培養(yǎng)液體積的增多，毛狀根干重及增殖倍數(shù)呈上升趨勢(shì)，采用250～500 mL的錐形瓶?jī)?nèi)裝100～200 mL培養(yǎng)液有利于毛狀根的生長(zhǎng)增殖。劉春朝等[26]研究表明青蒿毛狀根250 mL的三角瓶中搖瓶培養(yǎng)時(shí)，裝液量等于50 mL時(shí)，生物量及青蒿素合成量最優(yōu)，為其最適溶氧情況。

1.4 溫度

溫度不僅影響毛狀根生長(zhǎng)速率，而且對(duì)生物合成中的酶活性也起著重要的調(diào)節(jié)作用，毛狀根最適生長(zhǎng)溫度一般為20～28 ℃。不同藥用植物最適生長(zhǎng)溫度不同，其次代謝產(chǎn)物的積累對(duì)溫度的依賴性也因不同培養(yǎng)系而異。李紅波等[27]研究表明在25 ℃時(shí)，黃芩毛狀根生長(zhǎng)緩慢，僅為4 g，在26～28 ℃時(shí)生長(zhǎng)迅速，鮮重量不斷增加，可達(dá)到18.56 g，但當(dāng)溫度升至29 ℃時(shí)，毛狀根生長(zhǎng)接近終點(diǎn)，甚至減少，因此黃芩毛狀根生長(zhǎng)選擇最適溫度范圍為26～28 ℃。溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)在不同程度上抑制毛狀根的生長(zhǎng)，其中還發(fā)現(xiàn)高溫對(duì)毛狀根的抑制作用更為明顯，這也表明溫度是影響毛狀根生長(zhǎng)的一個(gè)重要因子。李翠芳[28]等將新疆紫草毛狀根分別置于14 ℃、18 ℃、22 ℃、26 ℃和30 ℃下培養(yǎng)，在14 ℃時(shí)毛狀根生長(zhǎng)量最低，26 ℃達(dá)到最高，而30 ℃時(shí)生長(zhǎng)下降；同時(shí)他們還研究新疆紫草毛狀根40 ℃高溫下培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h后，然后置于26 ℃培養(yǎng)30 d，毛狀根增殖倍數(shù)分別減少12.71%、14.07%、16.11%、17.10%，發(fā)現(xiàn)高溫處理時(shí)間越長(zhǎng)，毛狀根的生長(zhǎng)受抑制程度越大。

2 化學(xué)因素

不同培養(yǎng)基、碳源、氮源，以及添加外源激素等化學(xué)因素都會(huì)對(duì)毛狀根的生長(zhǎng)及次生代謝物的生物合成產(chǎn)生一定的影響[29-30]，可通過(guò)改變培養(yǎng)基中各種化學(xué)物質(zhì)種類及配比來(lái)研究最適于毛狀根生長(zhǎng)的化學(xué)因素，從而增加毛狀根的產(chǎn)量和次生代謝產(chǎn)物含量。

2.1 培養(yǎng)基種類

培養(yǎng)基的種類對(duì)毛狀根生長(zhǎng)及次生代謝物質(zhì)的積累也有很大的影響，不同植物種類有不同的最適培養(yǎng)基。選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基可以大幅度提高毛狀根生長(zhǎng)量。王沖之等[31]分析了1/2 MS、改良White、SJ-1、改良Nisch、B5和B5-I等6種液體培養(yǎng)基對(duì)西洋參毛狀根生長(zhǎng)及皂苷含量的影響，發(fā)現(xiàn)SJ-1和B5培養(yǎng)基較好。馬玲等[32]研究表明將假酸漿毛狀根分別接種于MS、1/2 MS、N6和B5不含激素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，MS液體培養(yǎng)基對(duì)毛狀根的增殖效果最佳，依次為N6﹥1/2 MS﹥B5。蘆韋華等[25]研究了新疆紫草毛狀根在無(wú)銨的液體培養(yǎng)基SH、MG-5、MS、1/2 MS及B5培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)新疆紫草毛狀根在低鹽無(wú)銨SH液體培養(yǎng)基中的增殖倍數(shù)較培養(yǎng)在其它培養(yǎng)基中有顯著提高。培養(yǎng)基對(duì)毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝物的積累又不完全一致，有利于毛狀根生物量增加的培養(yǎng)基，并不一定是其次生代謝物積累的最適培養(yǎng)基。因此，對(duì)不同植物的培養(yǎng)體系需根據(jù)其產(chǎn)量和代謝產(chǎn)物積累兩方面綜合考慮。高帥等[33]研究發(fā)現(xiàn)，金鐵鎖毛狀根在MS、1/2 MS、B5、6-7-V和White等5種培養(yǎng)的生長(zhǎng)都很快，其中在B5培養(yǎng)基生長(zhǎng)最好，干重增加了15.8倍；在White培養(yǎng)基的生長(zhǎng)最慢。而對(duì)于總皂苷的積累，在1/2 MS基本培養(yǎng)基中含量最高，其總皂苷含量為0.69%；在B5培養(yǎng)基中，總皂苷的積累最少，為0.24%，所以從毛狀根產(chǎn)量和總皂苷產(chǎn)量的積累考慮，1/2 MS液體培養(yǎng)基是毛狀根生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基。

2.2 碳源

大部分農(nóng)村的村莊規(guī)劃，對(duì)村民住宅的規(guī)劃規(guī)定十分粗略，相對(duì)簡(jiǎn)單。很多村莊規(guī)劃都只是對(duì)住宅的建筑朝向進(jìn)行了大致的規(guī)定，但是其他方面如建筑選址、建筑整體規(guī)劃等并沒(méi)有明確的規(guī)定。因而多數(shù)村民的住宅在建造的時(shí)候會(huì)“沿路而建”，住址建造的時(shí)候受地貌，交通的影響較大。同時(shí)住宅與住宅之間相隔較遠(yuǎn)，空置的閑地相對(duì)較多。因?yàn)橥鶗?huì)出現(xiàn)建筑排列不夠規(guī)則、居住點(diǎn)相對(duì)分散的情況，這也使得土地利用率大大降低，農(nóng)村土地的嚴(yán)重浪費(fèi)。同時(shí)也會(huì)使得在基礎(chǔ)設(shè)施的建設(shè)當(dāng)中，工程量變大、成本更高、利用率卻不足。

碳源作為能量物質(zhì)是培養(yǎng)基中不可缺少的主要成分，毛狀根培養(yǎng)基中不同的碳源和濃度對(duì)毛狀根的生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物積累有不同程度的影響。不同藥用植物種類對(duì)碳源的要求不同。田思迪等[34]發(fā)現(xiàn)在蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基中，金鐵鎖毛狀根生物量最大，顏色呈淺白色；以葡萄糖、果糖為碳源的培養(yǎng)基中，金鐵鎖毛狀根生長(zhǎng)速度下降，出現(xiàn)褐變現(xiàn)象；而以乳糖、麥芽糖、淀粉為碳源的培養(yǎng)基中，毛狀根生長(zhǎng)嚴(yán)重受到抑制。結(jié)果表明，金鐵鎖毛狀根利用蔗糖為碳源的能力較強(qiáng)；其研究還發(fā)現(xiàn)蔗糖濃度對(duì)毛狀根生長(zhǎng)及皂苷積累存在影響，當(dāng)蔗糖濃度為30 g·L-1，皂苷產(chǎn)量最高。蔗糖作為培養(yǎng)基中的重要碳源，以往的研究主要集中在培養(yǎng)基中的蔗糖濃度對(duì)毛狀根生長(zhǎng)及其次生代謝物積，發(fā)現(xiàn)其濃度大小與細(xì)胞或器官的生長(zhǎng)形態(tài)及次生代謝物質(zhì)的累積密切相關(guān)[35]。馬玲等[32]研究表明，在MS液體培養(yǎng)基中分別加入濃度不同的蔗糖毛狀根的增殖量呈現(xiàn)的是先逐漸增加，而后增殖倍數(shù)開(kāi)始逐漸減少的狀態(tài)，當(dāng)濃度達(dá)到30 g·L-1時(shí)，毛狀根的增殖量平均最多達(dá)到23.43倍。寧凝等[36]等研究表明，蔗糖濃度為3%時(shí)，對(duì)黃秋葵毛狀根的促進(jìn)作用最強(qiáng)，增殖倍數(shù)最高。

2.3 氮源

目前關(guān)于氮源含量、種類及其配比對(duì)毛狀根的生長(zhǎng)及次生代謝物質(zhì)積累的影響已有較多的研究，部分結(jié)果表明在毛狀根培養(yǎng)中銨鹽與硝酸鹽是最重要的氮源之一，銨態(tài)氮(NH4+)對(duì)毛狀根主根的生長(zhǎng)有促進(jìn)，并且能夠使主根茁壯變粗，但濃度變大超出承受范圍時(shí)反而會(huì)抑制根的生長(zhǎng)；硝態(tài)氮(NO3-)對(duì)新根的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，高濃度的NO3-會(huì)導(dǎo)致新根過(guò)多，從而使毛狀根變?yōu)榧?xì)軟狀態(tài)，因此，對(duì)于銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的配比應(yīng)是毛狀根培養(yǎng)基影響因素之一[37]。劉軍等[38]研究表明，液體培養(yǎng)基中NH4+：NO3-的濃度比為1：2時(shí)金鐵鎖毛狀根的生物量和皂苷積累量為最佳。氮源的種類和濃度對(duì)根系建成和發(fā)育有很大影響，除了硝酸鹽和銨鹽外，牛肉浸膏、水解乳蛋白、蛋白胨等氮源也對(duì)其有重要影響。李博華等[24]研究表明，四倍體菘藍(lán)毛狀根在含1.0 g·L-1水解酪蛋白或水解乳蛋白作為氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好，毛狀根分枝多產(chǎn)量高，而在以1.0 g·L-1酵母、蛋白胨、牛肉浸膏為氮源的培養(yǎng)基中，毛狀根生長(zhǎng)慢、分枝少且形態(tài)粗短。

2.4 磷源

磷源是毛狀根生長(zhǎng)發(fā)育及其次生代謝調(diào)節(jié)的必需元素之一。無(wú)機(jī)磷作為毛狀根培養(yǎng)基重要磷源，發(fā)現(xiàn)其濃度大小與毛狀根的生長(zhǎng)形態(tài)及次生代謝物質(zhì)的累積密切相關(guān)，無(wú)機(jī)磷不僅影響毛狀根的生長(zhǎng)速度，還影響毛狀根的次生代謝。歐少云等[17]研究表明，在不含無(wú)機(jī)磷的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的南美蟛蜞菊毛狀根細(xì)長(zhǎng)，分枝少，生長(zhǎng)勢(shì)弱，而在無(wú)機(jī)磷濃度為常規(guī)MS培養(yǎng)基用量的2～3倍時(shí)，毛狀根生長(zhǎng)較好，增長(zhǎng)率最高。劉軍等[38]研究表明，金鐵鎖毛狀根在低磷濃度時(shí)毛狀根生長(zhǎng)緩慢，在高磷濃度時(shí)毛狀根會(huì)出現(xiàn)褐化并且次生代謝能力下降，皂苷含量低，綜合考慮金鐵鎖毛狀根生長(zhǎng)速度和次級(jí)代謝能力，選擇濃度為6.25 mmol·L-1的無(wú)機(jī)磷為最優(yōu)。

另外，添加礦質(zhì)元素和有機(jī)物質(zhì)也可提高毛狀根產(chǎn)量和次生代謝產(chǎn)物含量。沈雙[39]等研究發(fā)現(xiàn)減少丹參毛狀根培養(yǎng)基中MgSO4·7H2O的含量，可以促進(jìn)毛狀根的生長(zhǎng)和丹參酮ⅡA的釋放。呂春茂等[40]發(fā)現(xiàn)鹽酸硫氨素、L-半胱氨酸、甲硫氨酸、L-亮氨酸和L-α-丙氨酸可促進(jìn)煙草毛狀根的生長(zhǎng)和輔酶Q10的合成，而酵母膏不利于煙草毛狀根的生長(zhǎng)和輔酶Q10的合成。

2.5 外源激素

NAA、IAA、IBA、GA、KT、ZT等是植物組織培養(yǎng)中的關(guān)鍵因子，不僅影響細(xì)胞生長(zhǎng)，還影響細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的合成[37]。盡管植物的毛狀根具有激素自主性，能在無(wú)激素的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，但適當(dāng)?shù)募尤爰に厝阅艽龠M(jìn)毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的合成[41]。楊世海等[42]研究了5種激素6-BA、NAA、IBA、KT、ZT對(duì)羅勒毛狀根生長(zhǎng)及多糖和總黃酮合成的影響，結(jié)果表明經(jīng)過(guò)外源激素KT、ZT處理的毛狀根生長(zhǎng)旺盛，而經(jīng)IBA、NAA、6-BA處理的毛狀根生長(zhǎng)緩慢，對(duì)毛狀根的生長(zhǎng)有輕微的抑制作用。并且5種激素對(duì)總黃酮的積累有明顯的促進(jìn)作用，其中經(jīng)KT處理的毛狀根總黃酮量可達(dá)原植物的3.2倍，是未加激素處理毛狀根的2倍。綜合生物量和次生代謝產(chǎn)物合成兩方面，確定KT為羅勒毛狀根培養(yǎng)最適外源激素。楊睿等[19]研究表明GA3對(duì)水母雪蓮毛狀根側(cè)根的產(chǎn)生有強(qiáng)烈促進(jìn)作用，GA3濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，毛狀根生長(zhǎng)量達(dá)到9.1 g·L-1(DW)，是基本培養(yǎng)條件下的1.2倍；總黃酮合成量達(dá)到936 mg·L-1，是基本培養(yǎng)條件下的1.5倍。0.5 mg·L-1GA3和0.5 mg·L-1IBA組合對(duì)毛狀根生長(zhǎng)和總黃酮合成最有利，生長(zhǎng)量為12.6 g·L-1(DW)，比基本培養(yǎng)條件時(shí)提高了70%；總黃酮合成量為1 287 mg·L-1，比基本培養(yǎng)條件下提高了一倍。寧凝等[36]研究表明，添加0.5 mg·L-16-BA培養(yǎng)的黃秋葵毛狀根增殖倍數(shù)比不添加任何外源激素培養(yǎng)的毛狀根增殖倍數(shù)低，添加0.5 mg·L-1NAA或IAA培養(yǎng)的毛狀根增殖倍數(shù)比不添加任何外源激素培養(yǎng)的狀根增殖倍數(shù)高，尤其是添加0.5 mg·L-1IAA培養(yǎng)的毛狀根增殖倍數(shù)更為顯著。外源激素對(duì)毛狀根的生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物積累并不同步。徐大衛(wèi)等[41]研究表明，2，4-D、6-BA、NAA、KT均能不同程度地影響圓葉牽牛毛狀根的生長(zhǎng)及其咖啡酸、咖啡酸乙酯的積累，其中2，4-D明顯抑制圓葉牽牛毛狀根的生長(zhǎng)，NAA、KT對(duì)圓葉牽牛毛狀根的生長(zhǎng)及其咖啡酸和咖啡酸乙酯均有促進(jìn)作用，最適宜培養(yǎng)濃度分別為0.5 mg·L-1和1.0～1.5 mg·L-1。ABA是植物重要的脅迫響應(yīng)信號(hào)，植物會(huì)在脅迫響應(yīng)敏感部位合成大量ABA，有研究顯示，ABA能夠誘導(dǎo)植物萜類成分的積累。盛東峰等[43]研究表明，隨著ABA處理時(shí)間的延長(zhǎng)，丹參毛狀根的生長(zhǎng)被抑制，但其丹參酮類的含量和終產(chǎn)量增加，ABA能夠促進(jìn)毛狀根丹參酮類的積累。

3 前體物質(zhì)的應(yīng)用

在植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)中，添加前體物質(zhì)是提高培養(yǎng)物中次級(jí)代謝產(chǎn)物含量有效的手段[30]。前體物質(zhì)作為細(xì)胞次生代謝合成中的起始或中間產(chǎn)物，可以促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成。Sykowska-Baranek等[44]研究了在紅豆杉毛狀根中添加L-苯丙氨酸、P-氨基苯甲酸、茉莉酸甲醋、使紫杉醇、10-DAB Ⅲ含量大幅增加，證明前體物質(zhì)對(duì)次生代謝起到一定影響。馬琳等[45]研究表明，不同濃度的丙酮酸鈉對(duì)人參毛狀根的生長(zhǎng)起到明顯的促進(jìn)作用，其中最佳濃度為5 mmol·L-1，而L-苯丙氨酸對(duì)毛狀根的生長(zhǎng)的促進(jìn)作用并不明顯，不同濃度的P-氨基苯甲酸對(duì)人參毛狀根的生長(zhǎng)起到了抑制作用。馮慧娜等[15]研究表明，煙酸和異亮氨酸能促進(jìn)雷公藤毛狀根的生長(zhǎng)及干重的增加，但是煙酸、異亮氨酸和天冬氨酸對(duì)其內(nèi)酯醇的產(chǎn)生，以及異亮氨酸和天冬氨酸的產(chǎn)生則具有不同程度的抑制作用，因此，需要綜合考慮前體物質(zhì)種類和用量。

4 誘導(dǎo)子

誘導(dǎo)子(又稱激發(fā)子)是指能誘發(fā)植物產(chǎn)生保衛(wèi)素并能產(chǎn)生防御反應(yīng)的物質(zhì)[46-48]?，F(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)在植物與微生物的相互作用中，誘導(dǎo)子能快速地、高度專一地和選擇性地誘導(dǎo)特異基因的表達(dá)[49-50]。人們根據(jù)誘導(dǎo)子來(lái)源不同可分為生物誘導(dǎo)子(biotic elicitor)與非生物誘導(dǎo)子(abiotic elicitor)。

4.1 生物誘導(dǎo)子

生物誘導(dǎo)子是指來(lái)源于微生物或者動(dòng)植物細(xì)胞的化合物，主要包括病原菌(真菌、細(xì)菌、病毒與酵母)和植物細(xì)胞壁的分離物，目前應(yīng)用最廣、研究最多的是真菌類誘導(dǎo)子[18]。沈雙等[51]研究表明，50 μg·mL-1的紅花鏈格孢菌誘導(dǎo)子可以促使丹參毛狀根中獲得最高的二氫丹參酮Ⅰ和丹參酮Ⅱ的產(chǎn)量，分別是對(duì)照的3.16和1.25倍，然而丹參毛狀根中最高的隱丹參酮和丹參酮Ⅱ的產(chǎn)量由250 μg·mL-1的瓜枝孢菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)獲得，分別是對(duì)照產(chǎn)量的5.24和1.43倍。結(jié)果也表明這兩種真菌誘導(dǎo)子不僅可以提高丹參酮類成分的含量，同時(shí)也能促進(jìn)毛狀根的生長(zhǎng)。不同真菌誘導(dǎo)子之間存在協(xié)同效應(yīng)，按一定比例混合使用可提高毛狀根產(chǎn)量和次生代謝物積累。張璞等[52]將黑曲霉、米曲霉誘導(dǎo)子及其混合誘導(dǎo)子添加到M-9培養(yǎng)基中來(lái)培養(yǎng)新疆紫草毛狀根，培養(yǎng)10 d時(shí)以2.5∶ 50的比例添加混合誘導(dǎo)子，總萘醌含量是對(duì)照的2.28倍；混合誘導(dǎo)子對(duì)毛狀根增殖有促進(jìn)作用，可大幅提高新疆紫草毛狀根萘醌含量。

4.2 非生物誘導(dǎo)子

非生物誘導(dǎo)子是指那些不能由生物體提供的起誘導(dǎo)作用的理化因子，主要包括茉莉酸甲酯(MeJA)、水楊酸(SA)及重金屬與稀土元素鹽類等[49]。非生物誘導(dǎo)子對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物積累具有促進(jìn)作用已有相關(guān)報(bào)道。楊世海[42]等研究表明，MeJA總體上對(duì)羅勒毛狀根生長(zhǎng)起到抑制作用，濃度越高，抑制作用越明顯，但MeJA對(duì)毛狀根中總黃酮合成具有明顯的促進(jìn)作用，其濃度為50 μmol·L-1作用最強(qiáng)，總黃酮量是原植物的3.1倍，是未加激素處理的2倍。同時(shí)，他們還研究了水楊酸(SA)對(duì)羅勒毛狀根的影響，研究發(fā)現(xiàn)SA對(duì)毛狀根生長(zhǎng)的影響作用不顯著，但對(duì)總黃酮的積累有明顯促進(jìn)作用，濃度為20 μmol·L-1SA可使總黃酮達(dá)到83.561 μg·mg-1，是原植物的2.9倍，是未加激素處理毛狀根總黃酮量的1.9倍。沈雙等[51]研究表明，ABA和PEG在不同處理濃度下均顯著抑制了丹參毛狀根的生長(zhǎng)，而對(duì)于毛狀根中4種丹參酮類成分的積累卻有不同程度的促進(jìn)作用，ABA和PEG促進(jìn)丹參毛狀根丹參酮積累的最佳濃度分別為200 μmol·L-1和2%。靳浩淼等[53]研究表明，水楊酸對(duì)西洋參毛狀根的最佳添加濃度為0.6 mg·L-1，作用時(shí)間為144 h。茉莉酸甲酯的最佳添加濃度10 μmol·L-1，作用時(shí)間為192～240 h。幾種非生物誘導(dǎo)子按一定比例混合對(duì)植物次生代謝的增加有明顯的協(xié)同作用。徐立新等[54]通過(guò)向人參毛狀根培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯和水楊酸，發(fā)現(xiàn)2種誘導(dǎo)子在適當(dāng)?shù)臐舛认?，?duì)人參皂苷含量的增加具有明顯的協(xié)同作用，當(dāng)MeJA和SA濃度均為1 μmol·L-1時(shí)，其對(duì)總皂苷和單體皂苷的積累比二者單獨(dú)作用要大。

5 生物反應(yīng)器在毛狀根上的應(yīng)用

生物反應(yīng)器培養(yǎng)植物細(xì)胞具有工作體積大、單位體積生產(chǎn)能力高、物理和化學(xué)條件控制方便、不受時(shí)間和地點(diǎn)限制、隨時(shí)隨地規(guī)模化生產(chǎn)等許多優(yōu)點(diǎn)[55]，使用生物反應(yīng)器培養(yǎng)藥用植物毛狀根已經(jīng)得到廣泛推廣，我國(guó)已開(kāi)始對(duì)長(zhǎng)春花、三七、紫草、紅豆杉等珍貴藥用植物毛狀根的大規(guī)模培養(yǎng)進(jìn)行了探索[56]。到目前為止，毛狀根已在攪拌式、氣升式、噴淋床、霧化式等各種形式的生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)研究。不同植物的毛狀根根據(jù)其性狀和培養(yǎng)條件的不同而應(yīng)選擇不同的生物反應(yīng)器，以有利于毛狀根生物量和次生代謝產(chǎn)物的積累。邱德友等[57]利用10 L的球狀氣升式反應(yīng)器進(jìn)行了丹參毛狀根培養(yǎng)的初級(jí)放大試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)球狀氣升式反應(yīng)器培養(yǎng)50 d時(shí)丹參毛狀根的增殖倍數(shù)為241.71倍。李翠芳等[58]采用超聲提取法對(duì)新疆紫草固體培養(yǎng)毛狀根、液體培養(yǎng)毛狀根以及2～3年生根中的總糖和多糖進(jìn)行了提取測(cè)定。結(jié)果表明，毛狀根中水溶性總糖含量為25.573%，是野生根總糖含量的3.4倍；固體培養(yǎng)的毛狀根多糖含量最高，達(dá)4.289%，是液體培養(yǎng)毛狀根的3.37倍，是野生根的4倍。

6 展望

農(nóng)桿菌介導(dǎo)產(chǎn)生的植物毛狀根培養(yǎng)體系已成為生物技術(shù)生產(chǎn)和提高藥用植物次生代謝產(chǎn)物的一種有效途徑[59-60]。毛狀根生長(zhǎng)速率和其代謝產(chǎn)物合成能力受物理和化學(xué)等因素的影響，添加有機(jī)物和誘導(dǎo)子也能提高毛狀根中次生代謝產(chǎn)物含量。已有報(bào)道龍膽、黃花蒿和丹參[61-62]等藥用植物成功誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根，優(yōu)化培養(yǎng)條件，獲得環(huán)烯醚萜類、青蒿素等次級(jí)代謝產(chǎn)物；但是在毛狀根培養(yǎng)中，摸索出能夠能同時(shí)滿足提高毛狀根產(chǎn)量和次生代謝含量的培養(yǎng)條件還比較困難，因此創(chuàng)新出一套對(duì)毛狀根生物量和次級(jí)代謝產(chǎn)物積累均有效的培養(yǎng)篩選模式，對(duì)毛狀根生產(chǎn)具有重要意義。

目前通過(guò)毛狀根來(lái)生產(chǎn)天然活性物質(zhì)還處于發(fā)展階段，并且大多處于實(shí)驗(yàn)室中，要實(shí)現(xiàn)用毛狀根大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)天然活性物質(zhì)還有很多問(wèn)題要解決[18]。一方面由于毛狀根在生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液中物質(zhì)的轉(zhuǎn)移，毛狀根生長(zhǎng)時(shí)易成團(tuán)，限制了營(yíng)養(yǎng)和氧氣的進(jìn)入，致使目前的生物反應(yīng)器還難以滿足毛狀根大規(guī)模培養(yǎng)[58]；另一方面毛狀根發(fā)酵水平很低，生產(chǎn)的成本高，也無(wú)法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。為了提高生物產(chǎn)量，開(kāi)發(fā)新型生物反應(yīng)器和建立新的培養(yǎng)方法也是實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的重要步驟。

此外，對(duì)毛狀根次生代謝途徑和調(diào)控機(jī)理的研究，將有利于從根本上提高毛狀根次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[18]。我們還應(yīng)該著重考慮將反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)與工程技術(shù)、智能?？丶夹g(shù)結(jié)合起來(lái)，提高生物反應(yīng)器的使用效率，從而實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)，這將為毛狀根培養(yǎng)用于生產(chǎn)藥用植物次生代謝產(chǎn)物的工業(yè)化發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

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ResearchProgressonVariousInfluencesinHairyRootYieldandSecondaryMetabolitesAccumulationofMedicinalPlant

SUN Jing1，2，YANG Hongyi2，SUI Chun2，3*

(1.CollegeofLifeScience，NortheastForestryUniversity，Haerbin150040，China； 2.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China； 3.KeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandResourcesUtilizationofChineseHerbalMedicine，MinistryofEducation，Beijing100193，China)

There are about 30% of medicinal plants with roots as effective parts.Hairy roots cultures are new approach for the production of secondary metabolites Many factors affect the growth of hairy roots and its secondary metabolites output，such as physical，chemical factors，precursors and fungal elicitors，etc.The high yield of hairy roots and metabolites could be obtained according to optimization of culture conditions and medium content.In this paper，we reviewed the factors and its relative mechanism involving in the inductive formation of hairy root，large-scale root yield，and productions of secondary metabolites，thus provides valuable references for further related research and application.

Hairy root；Secondary metabolite；Factors

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.11.017

2014-03-19)

四川省“十二五”農(nóng)作物及畜禽育種攻關(guān)項(xiàng)目(2011NZ0098-12-11)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81072994)；北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(5102033)

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隋春，副研究員，研究方向：藥用植物基因資源和次生代謝調(diào)控；Tel：(010)57833363，E-mail：csui@implad.ac.cn