施國明 蔡加彬 俞靜嫻 柯愛武 董兆如 張弛 張鵬飛 邱雙健 孫惠川 周儉 樊嘉

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科，上海 200032)

小鼠肝臟部分切除(partial hepatectomy，PH)模型是研究肝臟再生、急性肝損傷及肝腫瘤發(fā)生等的常用模型。此類模型的理想要求是:動(dòng)物存活率高、可操作性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作時(shí)間短等［1-4］。目前，國際上采用顯微技術(shù)切除小鼠2/3肝臟的成功率為96%［5-6］。本研究在傳統(tǒng)結(jié)扎法基礎(chǔ)上制作小鼠肝臟大部分切除的改進(jìn)型模型，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 戊巴比妥鈉(美國Sigma公司);6-0 proline縫線(美國強(qiáng)生生物公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8～10周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠50只(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)，體質(zhì)量(30±2)g，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=30)、對照組(n=10)和空白組(n=10)。小鼠于恒溫(21～22℃)動(dòng)物房中飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲食及飲水。

1.3 手術(shù)操作方法 用0.9%氯化鈉溶液配制1%的戊巴比妥鈉溶液，腹腔注射10 μL/g麻醉小鼠，將麻醉后的小鼠取仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，腹部剃毛，用聚維酮碘消毒。用剪刀沿小鼠兩下肋弓連線(腹部中部)偏左的位置橫行剪開2.0～3.0 cm切口，全層切開腹壁，如腹壁動(dòng)脈出現(xiàn)活動(dòng)性出血，則用6-0 proline縫線縫扎止血;助手用眼科鑷向上輕輕牽引肋弓，并剪離肝鐮狀韌帶;用干棉簽輕輕牽引肝左外葉、肝中葉，用眼科剪離斷肝胃韌帶、左外葉與右側(cè)膈肌韌帶、肝左外葉與右腎間的肝腎韌帶等，最后完全游離肝左外葉和肝中葉;用6-0 proline縫線經(jīng)肝中葉與肝右葉間的肝裂隙環(huán)繞肝左外葉和肝中葉的共同肝蒂，用6-0 proline縫針在肝蒂上方0.2 cm處穿右中葉肝表面，并用縫線結(jié)扎肝蒂，待肝左外葉和肝中葉顏色變暗紅，在結(jié)扎線上方0.2 cm處切除小鼠肝臟的左外葉、左中葉和右中葉;檢查肝切面有無滲血;用3-0尼龍線將小鼠腹肌、皮膚逐層縫合，消毒切口，皮下注射0.5 mL 0.9%氯化鈉溶液。將手術(shù)后的小鼠采取右側(cè)臥位，置于干燥柔軟的紗布之上，在37℃的熱板上復(fù)溫至小鼠蘇醒。術(shù)后3 d、7 d、14 d，分別取10只小鼠，用1%戊巴比妥鈉溶液麻醉后處死，觀察肝臟再生情況、稱肝臟質(zhì)量;觀察術(shù)后14 d時(shí)小鼠存活情況。對照組小鼠的處理:開腹，用眼科剪游離與肝臟相連的韌帶后，對小鼠進(jìn)行切口縫合消毒，術(shù)后7 d處死。空白組小鼠處理:未行手術(shù)處理，直接麻醉后處死，觀察肝及各肝葉質(zhì)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠肝臟大部分切除術(shù)后存活情況 成功制作改良C57BL/6小鼠肝臟大部分切除模型。小鼠肝總質(zhì)量(1.5±0.04)g;其中，肝左外葉和肝中葉(包括肝右中葉、肝左中葉)質(zhì)量(1.0 ±0.02)g，占肝總質(zhì)量的66.7%。因此，切除小鼠肝左外葉和肝中葉可以制備肝大部分切除模型。在小鼠肝大部分切除的手術(shù)過程中及手術(shù)后14 d內(nèi)，小鼠存活率100%(30/30)。

2.2 小鼠肝再生情況 小鼠肝左外葉和肝中葉切除后，小鼠肝臟質(zhì)量逐漸增加，術(shù)后第3天小鼠肝質(zhì)量達(dá)原肝總質(zhì)量的58.2%，術(shù)后第7天小鼠肝質(zhì)量達(dá)原肝總質(zhì)量的78.0%，術(shù)后第14天小鼠肝質(zhì)量恢復(fù)至切除前原肝總質(zhì)量的93.2%。

3 討 論

制備小鼠肝臟大部分切除后再生模型是研究肝臟再生的基礎(chǔ)，目前國內(nèi)外報(bào)道有4種小鼠肝臟大部分切除后再生模型的制備方法，包括傳統(tǒng)大部結(jié)扎法［7］、止血夾法［8］、基于血管定位的肝實(shí)質(zhì)保留法［9］和基于血管定位的顯微手術(shù)法［10］。這些模型各具特點(diǎn)，其中以傳統(tǒng)大部結(jié)扎法最為經(jīng)典和常用。Mitchell等［7］在傳統(tǒng)大部結(jié)扎法中分步依次切除肝左外葉和肝中葉，小鼠手術(shù)死亡率為零，但這種方法操作時(shí)間較長(15～20 min)。當(dāng)肝中葉和左外葉一并結(jié)扎時(shí)，該方法易致下腔靜脈狹窄和肝臟充血，小鼠手術(shù)死亡率較高。止血夾法，即在傳統(tǒng)結(jié)扎法中用鈦金屬止血夾代替絲線，雖然手術(shù)時(shí)間明顯縮短，但仍可能引起下腔靜脈狹窄和肝臟充血，導(dǎo)致小鼠手術(shù)中死亡。血管定位的肝實(shí)質(zhì)保留法和顯微手術(shù)法雖然可顯著降低因結(jié)扎導(dǎo)致的下腔靜脈阻塞的風(fēng)險(xiǎn)，與臨床肝段切除術(shù)更接近，但這兩種手術(shù)方法需要顯微外科設(shè)備，技術(shù)要求較高，且手術(shù)耗時(shí)較長，不易推廣。

本研究在傳統(tǒng)大部結(jié)扎法的基礎(chǔ)上，采用6-0 proline縫線環(huán)繞肝左外葉和肝中葉的共同肝蒂，并穿肝右中葉淺部固定繞肝蒂線，結(jié)扎并切除肝左外葉和肝中葉。這一技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于:(1)既可以避免傳統(tǒng)結(jié)扎法因結(jié)扎位太高而導(dǎo)致的下腔靜脈狹窄，又可以防止因結(jié)扎線脫落致大出血，小鼠的成活率100%;(2)結(jié)扎一步完成，操作簡單，耗時(shí)短(10～12 min);(3)不需顯微器械和技術(shù)，易于推廣。這項(xiàng)技術(shù)的缺點(diǎn)是術(shù)中用6-0 proline縫線代替?zhèn)鹘y(tǒng)大部結(jié)扎法應(yīng)用的絲線，成本相對較高。

本研究發(fā)現(xiàn)，切除小鼠肝左外葉和肝中葉后，肝臟出現(xiàn)代償性增生，術(shù)后第7天可恢復(fù)至原肝總質(zhì)量78.0%，術(shù)后14天恢復(fù)至原肝總質(zhì)量93.2%。因此，本研究建立的小鼠肝臟大部分切除后再生模型完全符合肝臟再生研究的要求，可應(yīng)用于肝再生及肝腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制研究。

［1］Ding BS，Nolan DJ，Butler JM，et al.Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration［J］.Nature，2010，468(7321):310-315.

［2］Yuan H，Zhang H，Wu X，et al.Hepatocyte-specific deletion of Cdc42 results in delayed liver regeneration after partial hepatectomy in mice［J］.Hepatology，2009，49(1):240-249.

［3］Natarajan A，Wagner B，Sibilia M.The EGF receptor is required for efficient liver regeneration［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(43):17081-17086.

［4］Haga S，Ozaki M，Inoue H，et al.The survival pathways phosphatidylinositol-3 kinase(PI3-K)/phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1)/Akt modulate liver regeneration through hepatocyte size rather than proliferation［J］.Hepatology，2009，49(1):204-214.

［5］Greene AK，Puder M.Partial hepatectomy in the mouse:technique and perioperative management［J］.J Invest Surg，2003，16(2):99-102.

［6］Fausto N，Campbell JS，Riehle KJ.Liver regeneration［J］.J Hepatol，2012，57(3):692-694.

［7］Mitchell C，Willenbring H.A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice ［J］.Nat Protoc，2008，3(7):1167-1170.

［8］Nikfarjam M，Malcontenti-Wilson C，F(xiàn)anartzis M，et al.A model of partial hepatectomy in mice ［J］.J Invest Surg，2004，17(5):291-294.

［9］Madrahimov N，Dirsch O，Broelsch C，et al.Marginal hepatectomy in the rat:from anatomy to surgery［J］.Ann Surg，2006，244(1):89-98.

［10］Kubota T，Takabe K，Yang M，et al.Minimum sizes for remnant and transplanted livers in rats［J］.J Hepa Pancr Surg，1997，4(4):398-404.