伍嬌嬌 馮定慶 田 園 徐漢杰 李 兵 凌 斌

組蛋白乙?；揎椪{(diào)控RAR-β2表達(dá)與宮頸病變的相關(guān)性*

伍嬌嬌 馮定慶 田 園 徐漢杰 李 兵 凌 斌

目的：探討組蛋白乙?；揎椗cRAR-β2表達(dá)及宮頸病變發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法：收集正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅱ～Ⅲ和宮頸鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）組織，分別采用免疫組織化學(xué)和Western Blot方法檢測AcH3、RAR-β2和Involucrin的表達(dá)；分析組蛋白乙?；脚cRAR-β2表達(dá)及宮頸病變程度的關(guān)系。結(jié)果：隨著宮頸病變的進(jìn)展，AcH3、RAR-β2和Involucrin的表達(dá)逐漸降低，甚至缺失，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；組蛋白乙?；脚cRAR-β2表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.797，P＜0.05），AcH3和RAR-β2的表達(dá)均與宮頸病變程度呈負(fù)相關(guān)［r=-0.547（AcH3），r=-0.585（RAR-β2），P＜0.05］。結(jié)論：組蛋白乙酰化修飾與RAR-β2表達(dá)調(diào)控有關(guān)，并可能參與宮頸癌的發(fā)生。

組蛋白乙酰化修飾 RAR-β2宮頸上皮內(nèi)瘤變 宮頸鱗狀細(xì)胞癌 分化

Department of Obstetrics and Gynecology,Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University,Anhui Provincial

Key Laboratory of Molecular Medicine,Hefei 230001,China.

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China(Grant Nos.81072127 and 30901606),Anhui Pro

vincial Natural Science Foundation(Grant No.11040606M176),and Scientific Research Foundation of Universities and Colleg

es,Anhui Medical University(No.2012XKJ046).

宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤之一，其病因與高危型HPV感染宮頸上皮基底細(xì)胞，導(dǎo)致上皮分化成熟障礙，繼而惡性轉(zhuǎn)化；病變經(jīng)歷了宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級到宮頸癌的漸進(jìn)過程，但具體機制仍不明確。RAR-β2是一種重要的腫瘤抑制基因，在上皮細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其表達(dá)降低/缺失與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［1-2］。最新的研究證實，組蛋白乙酰化修飾通過表觀遺傳途徑調(diào)控多種與細(xì)胞周期、分化、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，通過與RAR-β2基因啟動子區(qū)RARE直接作用，調(diào)控RAR-β2的表達(dá)，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［3-4］。本研究擬檢測不同宮頸病變組織中組蛋白乙?；郊癛AR-β2的表達(dá)情況，分析兩者之間的相關(guān)性，從而探討其與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例與組織標(biāo)本來源 收集安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院2011年1月至2012年9月間CINⅡ～Ⅲ和宮頸鱗狀細(xì)胞癌（cervical squamous cell carcinoma，SCC）石蠟包埋標(biāo)本56例。其中CINⅡ～Ⅲ26例，SCC 30例；依據(jù)FIGO（2009年）宮頸癌臨床分期，Ⅰ期22例（Ⅰa期10例，Ⅰb期12例），Ⅱ期8例（全部為Ⅱa期）；選擇因子宮肌瘤行子宮全切的正常宮頸組織10例作對照。

收集2012年5～11月間手術(shù)切除的新鮮宮頸病變組織16例，其中，CINⅡ～Ⅲ8例（陰道鏡活檢下病理確診為CINⅡ～Ⅲ的宮頸病變部位，在LEEP術(shù)前用活檢鉗取上述部位），SCC 8例，Ⅰ期5例（Ⅰa期2例，Ⅰb期3例），Ⅱ期3例（全部為Ⅱa期），收集因子宮肌瘤行子宮全切的正常宮頸組織6例作對照。所有標(biāo)本均保存于-80°C冰箱中待用。

以上全部病例手術(shù)前均未行放化療、免疫治療及其它特殊治療，病例資料完整。

1.1.2 試劑 AcH3單克隆抗體、RAR-β2多克隆抗體、Involucrin單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體均購于美國Santa Cruz公司。免疫組織化學(xué)染色SP試劑盒、抗原修復(fù)液、DAB顯色劑及Western Blot用辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG的山羊抗兔、抗小鼠二抗均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色（SP法） 石蠟切片脫蠟至水，枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗4°過夜（AcH3、RAR-β2、Involucrin抗體稀釋度分別是1∶50、1∶50、1∶100），滴加聚合物輔助劑室溫20 min，滴加辣根酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫20 min，DAB染色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。PBS代替一抗作陰性對照，已知陽性標(biāo)本作陽性對照。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為AcH3、RAR-β2表達(dá)陽性細(xì)胞，以細(xì)胞膜/質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色為Involucrin表達(dá)陽性細(xì)胞。每張切片按著色強度分為，0分：無染色，1分：弱表達(dá)，2分：中表達(dá)，3分：高表達(dá)；每張切片選擇5個不同視野（×200），按著色細(xì)胞百分比，取5個視野的平均值即為每張切片的陽性細(xì)胞率，0分：陰性，1分：＜10%，2分：11%～50%，3分：51%～80%，4分：＞80%。以強度和面積得分的乘積評價表達(dá)情況［5］，范圍0～12分，0分：陰性（-），1～4分：低表達(dá)，＞4分：高表達(dá)。

1.2.2 Western Blot 在冰上剪碎CINⅡ～Ⅲ和SCC組織、提取總蛋白并定量，以40 μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離、電轉(zhuǎn)、5%脫脂奶粉封閉（TBS-T稀釋）、一抗孵育4℃過夜（AcH3、RAR-β2、Involucrin、GAPDH稀釋度分別是1∶100、1∶100、1∶500、1∶2 000）、對應(yīng)二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h、化學(xué)發(fā)光法顯影。運用Alpha Innotech成像系統(tǒng)采集圖像，對條帶光度掃描，檢測各目的蛋白與其對應(yīng)內(nèi)參的OD值，以各OD目的蛋白/OD內(nèi)參比值，取平均值統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件行χ2檢驗和t檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)檢測

AcH3、RAR-β2、Involucrin在正常宮頸、CINⅡ～Ⅲ和SCC組織中的表達(dá)（圖1）。AcH3、RAR-β2主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，Involucrin主要定位于細(xì)胞膜/質(zhì)。AcH3、RAR-β2、Involucrin在正常宮頸組織的陽性表達(dá)率分別是100%、90%、100%（10/10、9/10、10/10），顯著高于CINⅡ～Ⅲ組織84%、76%、88%（22/26、20/26、23/26）及SCC組織46%、46%、33%（14/30、14/30、10/30）；在宮頸病變過程中，AcH3、RAR-β2、Involucrin表達(dá)逐漸降低，甚至缺失，三者的表達(dá)在各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.2 組蛋白乙酰化水平與RAR-β2表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，組蛋白乙?；脚cRAR-β2的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.797，P＜0.05，圖2），即隨著宮頸病變的進(jìn)展，兩者表達(dá)同步降低。這與文獻(xiàn)報道一致［3］，在宮頸病變上皮細(xì)胞中RAR-β2的表達(dá)受組蛋白乙酰化水平的調(diào)控。

2.3 AcH3、RAR-β2與宮頸病變程度的相關(guān)性

在正常宮頸、CINⅡ～Ⅲ、SCC組織中AcH3和RAR-β2的表達(dá)均依次降低，即宮頸病變越重，兩者的表達(dá)越低，與病變程度呈負(fù)相關(guān)［r=-0.547（AcH3），r=-0.585（RAR-β）2，P＜0.05，圖3］。

2.4 Western Blot檢測

AcH3、RAR-β2、Involucrin在正常宮頸、CINⅡ～Ⅲ和SCC組織中的表達(dá)見圖4。結(jié)果顯示，AcH3、RAR-β2、Involucrin的表達(dá)與免疫組化結(jié)果一致，在正常宮頸、CINⅡ～Ⅲ、SCC組織中逐漸降低。

3 討論

基因的表達(dá)除了決定于DNA序列所傳遞的遺傳學(xué)信息外，還決定于DNA序列以外的表觀遺傳學(xué)信息。隨著對腫瘤認(rèn)識的深入，利用表觀遺傳學(xué)機制揭示腫瘤的發(fā)生發(fā)展受到眾多學(xué)者的關(guān)注，并認(rèn)為是腫瘤病理生理過程中最重要的分子事件之一。組蛋白乙酰化修飾在表觀遺傳學(xué)理論中占有重要地位，通過影響細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，參與特定位點的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在細(xì)胞生長、分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用；組蛋白富含賴氨酸、精氨酸、組氨酸等帶正電荷的堿性氨基酸，所謂的組蛋白乙酰化修飾是指組蛋白八聚體向外延伸的堿性氨基酸殘基乙?；?，通過增大DNA與組蛋白間的靜電引力和空間位組，兩者間相互作用減弱，選擇性的使某些染色質(zhì)區(qū)域的結(jié)構(gòu)從緊密變得松散，DNA易于解聚，染色質(zhì)呈轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)，有利于轉(zhuǎn)錄因子與DNA模板相結(jié)合，繼而開放某些基因轉(zhuǎn)錄，增強其表達(dá)水平；相反，組蛋白去乙?；?，即乙酰化水平降低，使帶正電荷的組蛋白與帶負(fù)電荷的DNA緊密結(jié)合，染色質(zhì)呈卷曲致密的抑阻結(jié)構(gòu)，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致調(diào)控細(xì)胞周期、分化、凋亡的基因轉(zhuǎn)錄失調(diào)。正常細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙?；腿ヒ阴；幱谄胶?，動態(tài)控制靶基因的穩(wěn)定表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臅r間和空間位置上表達(dá)適當(dāng)?shù)幕?，維持細(xì)胞正常的生理功能和表型，控制細(xì)胞的增殖分化；當(dāng)乙?；腿ヒ阴；Ш?，組蛋白乙?；浇档蜁r，將引起相應(yīng)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄改變，影響細(xì)胞周期、分化、增殖、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。在腫瘤細(xì)胞中組蛋白大多數(shù)呈去乙?；癄顟B(tài)［6-9］，隨著乙?；降慕档?，組織的異質(zhì)性程度也逐漸增加［10］；本實驗顯示，從正常宮頸、CIN、SCC組織中組蛋白乙?；街饾u降低，甚至缺失，與不同病變卵巢組織的研究結(jié)果相似［10］，組蛋白乙?；脚c宮頸病變程度呈負(fù)相關(guān)，說明表觀遺傳修飾參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

維甲酸（retinoic acid，RA）又稱視黃醇或維生素A酸，是維生素A的衍生物，機體內(nèi)一定濃度的維甲酸可調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、成熟，是正常生長發(fā)育和各種生理活動必不可少的因子之一。RA是通過與細(xì)胞核內(nèi)維甲酸受體（retinoic acid receptor，RAR）結(jié)合而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和成熟，發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。RAR-β2是RAR-β家族中最重要的成員，也是RA可誘導(dǎo)的主要亞型，與RA結(jié)合調(diào)控細(xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞分化等而產(chǎn)生抗腫瘤活性，因此，RAR-β2在多種腫瘤中認(rèn)為是一個腫瘤抑制基因。RAR-β2不但在癌組織中表達(dá)減少或缺失，而且在癌前病變組織中的表達(dá)同樣是減少或缺失［11-12］，這說明RAR-β2與腫瘤的發(fā)生緊密相關(guān)。利用轉(zhuǎn)染RAR-β2的腫瘤細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)，通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化而增加凋亡［13］，其缺失與腫瘤組織的分化程度有關(guān)［14］。Involucrin作為上皮細(xì)胞終末分化的標(biāo)記蛋白，是分化成熟的上皮細(xì)胞應(yīng)具備的功能蛋白，Involucrin的表達(dá)說明該細(xì)胞逐漸向正常分化成熟的方向發(fā)展或為分化成熟的上皮細(xì)胞，其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的分化程度密切相關(guān)，高分化的腫瘤細(xì)胞中較中低分化的腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)顯著增多，是判斷腫瘤細(xì)胞分化程度的重要標(biāo)記之一。本研究結(jié)果顯示，在正常宮頸、CIN、SCC組織中RAR-β2與Involucrin表達(dá)水平均依次降低，各組間的表達(dá)水平有顯著差異性，表明正常宮頸組織在轉(zhuǎn)變?yōu)镃IN的過程中，上皮細(xì)胞中RAR-β2與Involucrin同步發(fā)生了變化，使分化成熟的上皮細(xì)胞逐漸減少，甚至缺失，增加組織的異質(zhì)性，導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。

組蛋白作為染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)核小體的重要組成部分，翻譯后乙?；揎椧鹑旧|(zhì)結(jié)構(gòu)重塑在細(xì)胞周期、分化、凋亡的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］。有研究表明，RAR-β2基因啟動子沉默與組蛋白乙?；揎椨嘘P(guān)，并參與腫瘤的發(fā)生［3-4］，即組蛋白乙?；胶鈩討B(tài)調(diào)控細(xì)胞生長分化，組蛋白乙?；癄顟B(tài)減少，使細(xì)胞去分化、過度增殖，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。本課題組前期宮頸癌SiHa、HeLa細(xì)胞和裸鼠成瘤實驗結(jié)果顯示，組蛋白去乙?；敢种苿┞?lián)合ATRA（RA化合物）通過顯著上調(diào)組蛋白乙酰化水平而重啟宮頸癌細(xì)胞RAR-β2的表達(dá)，促進(jìn)上皮細(xì)胞終末分化標(biāo)記Involucrin表達(dá)的上調(diào)，使腫瘤細(xì)胞停滯在G1期，抑制腫瘤細(xì)胞生長，從而縮小腫瘤體積，發(fā)揮協(xié)同抗宮頸癌作用［15］；結(jié)合本次利用臨床組織研究顯示，隨著宮頸病變的進(jìn)展，組蛋白乙酰化程度越低，RAR-β2的表達(dá)也越低，兩者的表達(dá)呈正相關(guān)，同時，AcH3和RAR-β2均與宮頸病變程度呈負(fù)相關(guān)；表明組蛋白乙酰化修飾參與調(diào)控RAR-β2的表達(dá)，其乙?；皆降停瑢?dǎo)致RAR-β2表達(dá)減少，甚至缺失，使宮頸上皮基底細(xì)胞分化成熟障礙、出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化和細(xì)胞周期異常，從而參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程。

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（2013-07-15收稿）

（2013-10-24修回）

（本文編輯：賈樹明）

Correlation between cervical lesion development and histone acetylation modification that regulates RAR-β2expression

Jiaojiao WU,Dingqing FENG,Yuan TIAN,Hanjie XU,Bing LI,Bin LING
Correspondence to:Bin LING;E-mail:lingbin.ling@gmail.com

Objective:To investigate the relationship between cervical lesion development and histone acetylation that regulates RAR-β2expression.Methods:Immunohistochemistry and Western blot analysis were performed to detect AcH3,RAR-β2,and involucrin expression in normal cervical tissues as well as in tissues with cervical intraepithelial neoplasia(CIN)Ⅱ-Ⅲand squamous cell cervical carcinoma.The relationship among histone acetylation level,RAR-β2expression,and cervical lesion severity were analyzed.Results:AcH3,RAR-β2,and involucrin expression were reduced or absent with the progression of cervical lesions;significant differences were noted between the groups(P＜0.05).Histone acetylation level and RAR-β2expression were positively correlated(r=0.797,P＜0.05).AcH3 and RAR-β2expression,which were both associated with the cervical lesions,were negatively correlated[r=-0.547(AcH3), r=-0.585(RAR-β2),P＜0.05].Conclusion:Histone acetylation modification is associated with the regulation of RAR-β2expression.This process is also likely to participate in the carcinogenesis of cervical carcinoma.

histone acetylation modification,RAR-β2,cervical intraepithelial neoplasia,squamous cell cervical carcinoma,differentiation

10.3969/j.issn.1000-8179.20131140

伍嬌嬌 碩士，主治醫(yī)師。研究方向為婦科腫瘤臨床與基礎(chǔ)研究。

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽省分子醫(yī)學(xué)重點實驗室（合肥市230001）

*本文課題受國家自然科學(xué)基金項目（編號：81072127，30901606）、安徽省自然科學(xué)基金項目（編號：11040606M176）和安徽醫(yī)科大學(xué)高?？蒲谢痦椖浚ň幪枺?012XKJ046）資助

凌斌 lingbin.ling@gmail.com

E-mail：wubaiwanzjs@163.com