陳修文 李長(zhǎng)偉 賈國(guó)凱

(1. 湖南科技學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)工程系，湖南 永州 425199；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850)

海洋來源真菌的抗腫瘤抗真菌活性篩選

陳修文1李長(zhǎng)偉2賈國(guó)凱1

(1. 湖南科技學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)工程系，湖南 永州 425199；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850)

目的：將深海來源的16株真菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)與活性篩選，獲取活性菌株以供篩選藥源活性產(chǎn)物。分別經(jīng)真菌普通培養(yǎng)基和人工海水培養(yǎng)基發(fā)酵獲得樣品，采用MTT法測(cè)試抗腫瘤活性，紙片法測(cè)試抗真菌活性。結(jié)果：菌株中有3株經(jīng)過普通發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵和4株經(jīng)過海水培養(yǎng)基發(fā)酵的樣品在100 μg/mL濃度下對(duì)K562細(xì)胞的抑制率大于60%；抗真菌活性測(cè)試中，僅有菌株16-02-1的發(fā)酵樣品對(duì)受試白色念珠菌ATCC 10231和土曲霉W-1均呈現(xiàn)一定的抑制活性。結(jié)論：深海來源真菌在不同培養(yǎng)基中發(fā)酵獲得的樣品，抗腫瘤活性各不相同，經(jīng)過篩選獲得高活性菌株為尋找藥源活性產(chǎn)物提供了菌株。

深海來源真菌；抗腫瘤；抗真菌；MTT

海洋微生物包括海洋細(xì)菌、放線菌、真菌中發(fā)現(xiàn)了許多活性次級(jí)代謝物,其化學(xué)結(jié)構(gòu)豐富多樣、新穎獨(dú)特，是陸地生物所不具有的[1]。這些活性次級(jí)代謝物大多具有很強(qiáng)的生理活性,包括抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗凝血、降壓等,具有廣闊的藥用前景[2]。活性菌株資源是活性次級(jí)代謝產(chǎn)物研究的物質(zhì)基礎(chǔ)，而在生物活性篩選中大部分菌株并不表現(xiàn)出相應(yīng)的生物活性而無法用于活性產(chǎn)物研究。本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上摸索建立了無活性野生菌株轉(zhuǎn)化為活性突變株的技術(shù)方法，為拓展活性菌株資源提供了有效手段[3]。目前我們已通過相關(guān)技術(shù)手段對(duì)潮間帶來源的無活性放線菌和真菌進(jìn)行了相關(guān)研究[4-6]，分離闡明了原始菌株不生產(chǎn)突變株新產(chǎn)的活性化合物[7]，取得了較好成效。鑒于此，為了進(jìn)一步證實(shí)相關(guān)技術(shù)手段的廣泛適用性，我們對(duì)16株深海來源真菌進(jìn)行了抗腫瘤活性篩選，一方面活性菌株可直接用于活性產(chǎn)物研究，而無活性菌株則可通過上述技術(shù)手段進(jìn)行處理，使其轉(zhuǎn)化為活性突變株進(jìn)而用于活性產(chǎn)物研究[7-11]。

1 儀器、材料和試劑

1.1 儀器

1360 B型超凈工作臺(tái)（北京亞泰科隆公司），日本Sanyo公司生產(chǎn)的MIR-253型微生物培養(yǎng)箱、MLS-3750型高壓滅菌器、MOV-212型干熱滅菌箱、MCO175型細(xì)胞培養(yǎng)箱，ZHWY-2102大型恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司），Labofuge 400R型離心機(jī)（德國(guó)賀力氏公司），VERSAmax-BN03152型酶標(biāo)儀（美國(guó) MD公司），AE31 EF-INV型倒置熒光顯微鏡（麥克奧迪公司），MILLI-Q純水機(jī)（millipor公司）。

1.2 材料與試劑

真菌：大洋一號(hào)采集的海洋真菌包括ZBY-1(69.7386°E，24.175°S，水深200米處海水)，ZBY-2(14°45'3"N，44°59'0"S，水深250米處海水)，ZBY-3(174.2170°E，24.3444°S，水深800米處海水)；深海 3000～4000m 采集的真菌包括3A03,3A09,3A11,3A17,3A22,3A23,3A24,3A25，海洋三所采集的深海真菌包括16-01，16-02-1，16-02-3，16-02-5，19-01。

真菌PDA培養(yǎng)基：葡萄糖 2%、瓊脂 2%、NaCl 1.5%，20%的土豆水煮液配制。

真菌普通液體培養(yǎng)基（1#）：葡萄糖 2%、麥芽糖 1%、甘露醇 2%、谷氨酸 1%、蛋白胨 0.5%、酵母浸粉 0.3%，蒸餾水1000 ml (pH 6.0)。

人工海水發(fā)酵培養(yǎng)基(2#)：甘露醇 20%、麥芽糖 20%、葡萄糖 10%、味精 10%、KH2PO40.5%、MgSO4·5H2O 0.3%、酵母浸粉3%、玉米漿1%、海水素 33.4%、蒸餾水1000 ml。

細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)基：人白血病K562細(xì)胞（本研究所李松教授提供）、RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó) Gibco公司，Lot No.1403238）、胎牛血清（北京圣瑪生物技術(shù)研究所）。

試劑：MTT試劑（美國(guó)Amresco公司，批號(hào)0793）、青霉素（華北制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào) 070201））、鏈霉素（美國(guó) Amresco 公司，批號(hào)0558）。其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌株的傳代培養(yǎng)

16株深海真菌采用PDA培養(yǎng)基，挑取適量孢子在平板培養(yǎng)基上劃線，28℃培養(yǎng)，每天觀察菌落生長(zhǎng)情況，待孢子生長(zhǎng)成熟，用固體平板培養(yǎng)基反復(fù)劃線傳代3次后，接種于試管斜面培養(yǎng)基上，4℃冷藏并適時(shí)傳代。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)與樣品制備

將16株深海來源真菌在28℃活化培養(yǎng)3～5天后，刮取孢子適量，分別接種在兩個(gè)各含200 mL普通液體培養(yǎng)基和200 mL海水液體培養(yǎng)基的500 mL三角燒瓶中，于28°C、200 rpm搖床發(fā)酵9～10天。另取各真菌孢子適量，分別接種在含25 mL普通液體培養(yǎng)基的80 mL試管中，于28°C、210 rpm搖床發(fā)酵11～15天。根據(jù)各菌株生長(zhǎng)狀況適時(shí)終止培養(yǎng)，下?lián)u床得發(fā)酵液。發(fā)酵液中加體積比2倍量的丙酮，超聲破碎菌體，離心取上清液，減壓濃縮至不含丙酮，冷凍干燥，得各菌株的發(fā)酵提取樣品。精密稱量適量樣品，用80%的甲醇配成10 mg/mL的樣品溶液，供抗腫瘤活性測(cè)試。

2.3 抗腫瘤活性測(cè)試

MTT法[7,9]抗腫瘤活性測(cè)試 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，用新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基配成細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔200 μL，37℃培養(yǎng)1 h后每孔加樣品溶液2 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，判斷有無細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死的形態(tài)特征，必要時(shí)拍照。各加入MTT 20 μL，37℃孵育4 h。處理結(jié)束后于4℃、2000 rpm條件下離心20 min，吸去上清液，每孔各加150 μL DMSO，置酶標(biāo)儀上充分振蕩使MTT紫色產(chǎn)物完全溶解，測(cè)量每孔570 nm處的OD值。實(shí)驗(yàn)中全部測(cè)試樣品均設(shè)三個(gè)孔，取OD平均值，以空白對(duì)照組為100%按下式計(jì)算抑制率（IR%）：IR% = (OD空白-OD樣品)/OD空白×100%。

2.4 抗真菌活性測(cè)試

采用8 mm紙片法[12]，以5 mg·mL-1制霉菌素為陽性對(duì)照，測(cè)定各菌株發(fā)酵物萃取樣品對(duì)致病菌的抑制活性。分別吸取菌懸液100 μL均勻涂布于PDA平皿上，制備被試菌平板。再取對(duì)照和樣品溶液各15 μL吸附于已經(jīng)干法滅菌（170 oC，2 h）后的濾紙片，將該濾紙片貼于涂有致病菌的PDA培養(yǎng)基上，28 oC培養(yǎng)3～5天，若有活性則其周圍不會(huì)有菌落生長(zhǎng)，即形成抑菌圈。根據(jù)抑菌圈直徑判斷樣品的抑菌活性強(qiáng)弱。

3 結(jié)果

3.1 抗腫瘤測(cè)試結(jié)果

表 1 深海來源真菌野生發(fā)酵樣品100 μg·mL-1對(duì)K562細(xì)胞的抑制活性測(cè)試結(jié)果

3.2 抗真菌測(cè)試結(jié)果

1#和 2#發(fā)酵樣品對(duì)白色念珠菌的活性測(cè)試中，發(fā)現(xiàn)僅菌株16-02-1發(fā)酵樣品對(duì)受試白色念珠菌ATCC 10231和土曲霉W-1呈現(xiàn)一定的抑制活性， 1500 μg/片普通培養(yǎng)基發(fā)酵樣品對(duì)ATCC 10231和W-1的抑菌圈分別為21 mm（與15μg/片的制霉素相當(dāng)）和14 mm，但同劑量的海水培養(yǎng)基發(fā)酵樣品對(duì)ATCC 10231的抑菌圈直徑僅為16 mm，而對(duì)W-1則未顯示出明顯抑制作用。

4 討論

16株深海來源真菌的普通培養(yǎng)基與人工海水培養(yǎng)基發(fā)酵樣品對(duì)K562細(xì)胞的抑制活性顯示較為顯著的差別（結(jié)果見表 1），其中普通培養(yǎng)基發(fā)酵呈現(xiàn)高活性的部分菌株（如ZBY-1和16-02-5，其IR%分別為87.7%和83.6%）在用海水培養(yǎng)發(fā)酵時(shí)只呈現(xiàn)中等強(qiáng)度抗腫瘤活性（IR%分別降至50.2%和61.1%）；而用海水培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)呈現(xiàn)高活性的部分菌株（如19-01和3A22，其IR%分別為89.8%和89.7%）在改用普通培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)則只呈現(xiàn)較低抗腫瘤活性（IR%降至22.0%和32.8%）?？拐婢钚詼y(cè)試中，菌株16-02-1的1#和2#發(fā)酵樣品對(duì)受試白色念珠菌 ATCC 10231和土曲霉 W-1均呈現(xiàn)一定的抑制活性，但是二者所呈現(xiàn)的抑菌活性強(qiáng)度也具有較大差別。

上述結(jié)果提示，在深海真菌菌株活性篩選過程中培養(yǎng)基不同會(huì)導(dǎo)致其發(fā)酵產(chǎn)物活性產(chǎn)生較大差別，且大多菌株在經(jīng)多次傳代和不同批次發(fā)酵后，所得樣品生物活性波動(dòng)較大，與陸地或普通海域來源真菌相比，次級(jí)代謝相關(guān)遺傳穩(wěn)定性比較差，但同時(shí)也篩選獲得了活性測(cè)試結(jié)果比較穩(wěn)定的強(qiáng)活性菌株和無活性菌株。其中部分無活性菌株可供開展上述次級(jí)代謝改造相關(guān)研究，而包括16-02-1在內(nèi)的部分活性菌株則可用于直接開展活性產(chǎn)物研究。

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Antitumor and antifungal activities screening of deep sea sediment derived fungi

CHEN Xiu-wen1,2, LI Chang-wei2, JIA Guo-kai1

(1.Department of Biology and Chemistry, Hunan University of Science and Engineering, Yongzhou Hunan 425199, China; 2. Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China)

Abstrat: Objective:To investigate metabolites of sixteen strains isolated from a deep sea sediment for obtaining the bioactive metabolite producing strains. Methods:Sixteen fungi were fermented with ordinary medium and artificial seawater medium. Antitumor and antifungal activities were tested by MTT and paper-disc methods, respectively. Results There are 3 fungal strains fermented by ordinary medium among them inhibited the proliferation of K562 cells with the inhibition rates over 50% at the 100 μg/mL of concentration, samples from 5 fungal strains fermented by artificial seawater inhibited the proliferation of K562 cells with the inhibition rates over 40% at the 100μg/mL of concentration, only Strain 16-02-1 revealed both antitumor and antifungal activities. Conclusions:The results indicated that the production have different inhibitive femented in different medium, and obtain strains with high activity source for finding the active drug product provides strain.

fungus from deep sea sediment; antitumor; antifungal; MTT

Q5-3

A

1673-2219（2014）05-0080-03

2014－01－05

國(guó)家自然科學(xué)基金（81172976）資助。

陳修文（1987－），男，湖南永州人，湖南科技學(xué)院助教，碩士，研究方向?yàn)樘烊凰幬镩_發(fā)。

(責(zé)任編校：何俊華)