相 磊，袁記方，黃麗潔

(中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心，北京 100853)

胰腺是人體內(nèi)唯一同時具有內(nèi)分泌與外分泌兩種分泌功能的器官。胰腺的內(nèi)分泌功能由Langerhans小島(即胰島)中的許多不同類型的內(nèi)分泌細胞完成，這些內(nèi)分泌細胞主要包括α細胞、β細胞、δ細胞和PP細胞等。內(nèi)分泌細胞在胰腺細胞總數(shù)中占較小的比例，研究顯示在成年大鼠中內(nèi)分泌細胞約占4%[1]。胰島β細胞主要具有分泌胰島素的功能，胰島素是調(diào)節(jié)血糖濃度、促進合成代謝、調(diào)節(jié)細胞分化和生長發(fā)育的重要激素，體內(nèi)胰島素的絕對或相對不足，將導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。糖尿病目前在我國的發(fā)病率高達11.6%，已經(jīng)成為我國的一項嚴重公共健康問題。胚胎期胰腺的正常發(fā)育關(guān)系著成年期生物學(xué)功能的發(fā)揮，因此，對胰島β細胞發(fā)育的研究可以為糖尿病的臨床治療提供基礎(chǔ)資料。

1 胰腺β細胞的胚胎發(fā)育

胰腺起源于腸管內(nèi)胚層(gut endoderm)，它是脊椎動物原腸胚形成后三個胚層之一，經(jīng)過一系列的信號調(diào)節(jié)和逐級轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)最終發(fā)育為成熟的器官。大鼠的胰腺產(chǎn)生最早是在胚胎的E8～E8.5 d，在胚胎的第E13.5 d大部分分泌激素細胞(α、β、δ和PP細胞) 開始出現(xiàn)并組成內(nèi)分泌胰島[2]。胰腺β祖細胞的發(fā)育成熟需要經(jīng)過兩次的細胞躍遷，首先在Sox9、Sox4、NKx2.2、NKx6.1、GATA4、GATA6、Hlxb9、Pdx1、Ptf1α、Tcf2、Foxa2與HNF6等因子的調(diào)控下形成第一代胰腺祖細胞。繼而經(jīng)過Sox9、Sox4、GATA6、Pdx1、Tcf2、Foxa2與HNF6等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控形成第二代胰腺祖細胞，第二代胰腺祖細胞在Ngn3、Pdx1、Arx、Pax4、Pax6、NKx2.2和NKx6.1的調(diào)控下發(fā)育為幼稚型的胰腺β細胞，最后幼稚型胰腺β細胞在Nkx6.1、Pdx1、ISI、MafA、Pbx1、Hlxb9等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控下發(fā)育為成熟的胰腺β細胞。

2 胰腺β細胞的發(fā)育調(diào)控

2.1 Pdx1

Pdx1基因(pancreatic-duodenal homeobox 1 gene，Pdx1)中文譯名為胰十二指腸同源盒基因-1，是同源盒家族中的一員，Pdx1還有許多其它命名，如胰島素啟動子因子-1(IPF-1)、胰島/十二指腸同源盒-1(IDF-1)、生長激素抑制激素轉(zhuǎn)錄因子-1(STF-1)、胰島素上游因子-1(IUF-1)和葡萄糖敏感因子。

Pdx1在胚胎發(fā)育過程中促進胰腺的早期發(fā)育和晚期β細胞分化，在成熟β細胞中，Pdx1具有維持β細胞的形態(tài)和正常功能，尤其是維持胰島素分泌基因的正常運行。它也是胰腺發(fā)育必要的轉(zhuǎn)錄因子以及β細胞形成和成熟的標志。Pdx1表達于小鼠胚胎E8～E9 d的前腸管上皮，在E9～E10 d胰腺前體與胰腺上皮細胞內(nèi)均有表達，人類在孕后3～4周Pdx1開始表達，7周有胰島素的產(chǎn)生，12～13周胰島生成。在Pdx1基因敲除的小鼠與其單基因突變的人中均表現(xiàn)為胰腺發(fā)育不良[3-4]。敲除Pdx1基因的模型胰腺，其向外生長和近十二指腸的分化完全消失，但仍有胰芽內(nèi)分泌α細胞的分化，而且對胰腺間質(zhì)不產(chǎn)生影響[5]。在妊娠中期無內(nèi)分泌細胞出現(xiàn)的時候，Pdx1呈現(xiàn)低水平的表達，但是在妊娠的中后期胰腺β細胞出現(xiàn)時，Pdx1呈現(xiàn)高水平的表達。這也證實了Pdx1在胰腺的形成與β細胞分化方面都起著重要的作用。此外，Pdx1還是胰腺β細胞內(nèi)調(diào)節(jié)葡糖糖反應(yīng)的重要因子，通常情況下低血糖可以抑制 Pdx1基因表達。短期的血糖升高可以一定程度地刺激Pdx1基因表達，但長期的高血糖則使Pdx1基因表達明顯受抑。

2.2 Ngn3

神經(jīng)元素3(neurogen in 3，Ngn3)是NOTCH信號通路下游的一種BHLH轉(zhuǎn)錄因子，在CNS和胰腺中都有表達，Ngn3是胰腺內(nèi)分泌細胞分化的重要調(diào)控因子，研究證實胰腺所有內(nèi)分泌細胞的發(fā)育均需要Ngn3的調(diào)控。Ngn3缺失的小鼠出生后無胰島[6]。然而最近在斑馬魚的研究中胰腺與Ngn3缺失的胚胎中Asclb與Neuro1替代了Ngn3的功能，胰腺發(fā)育并不表現(xiàn)出缺陷，這提示在脊椎動物中存在其他內(nèi)分泌細胞分化調(diào)節(jié)因子[7]。Ngn3最早在小鼠胚胎中表達于E9 d，在E15 d時達到峰值，然而在E17.5 d時Ngn3在胰腺內(nèi)幾乎消失。Ngn3的表達受到Notch信號的抑制，Notch信號能夠促進Sox9基因的表達，當Sox9基因表達的時候能夠激活胰腺內(nèi)分泌前體細胞Ngn3基因的表達，然而當Notch信號高水平表達的時候則會激活Sox9的抑制物HES-1D的表達從而終止Sox9基因的表達，進而抑制了Ngn3的表達[8]。Ngn3調(diào)控著與胰島發(fā)育相關(guān)的3755個基因，其中有317個基因?qū)σ认賰?nèi)分泌細胞的發(fā)育起正向調(diào)節(jié)作用，175個基因起負向調(diào)節(jié)作用，757個基因在內(nèi)分泌細胞發(fā)育中是否具有表達還沒有確定[9]。

2.3 Pax

2.3.1 Pax4

胰島β細胞功能密切相關(guān)的胰島特異性轉(zhuǎn)錄因子-配對盒4(paired box4,Pax4)屬于編碼促進胚胎細胞增殖、分化及存活的轉(zhuǎn)錄因子家族。這類因子參與細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的高級調(diào)控，在胚胎發(fā)育過程中對細胞分化、更新、凋亡等都起著十分重要的調(diào)控作用。Pax4生理條件下對胰島β細胞的生存和增殖具有至關(guān)重要的作用，同時Pax4基因的多態(tài)性與糖尿病的發(fā)生相關(guān)。

Pax4是早期內(nèi)分泌祖細胞的標志，他主要指導(dǎo)β/δ系細胞的分化。胚胎發(fā)育過程中，Pax4轉(zhuǎn)錄最初在E9.5 d的胰腺胚芽中出現(xiàn)，胚胎E13.5～E15.5 d時達到高峰，然后下降至低表達水平。通過基因打靶技術(shù)提示，Pax4的缺乏可以導(dǎo)致胰島β細胞和δ細胞的成熟障礙和胰島α細胞的大量增加[10]。其中胰島α細胞的增加一方面由于胚胎時期被Pax4抑制的α細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Arx的表達增加。另一方面，Pax4的缺乏可以促使成體β細胞向α細胞和PP細胞轉(zhuǎn)化。Pax4還能提高成熟β的數(shù)量，通過抑制Pax6減少α細胞分化從而減少胰高血糖素的分泌。

2.3.2 Pax6

Pax6在脊椎動物的眼、腦和胰腺的發(fā)育過程中起著重要的作用。在Pax6b缺失的斑馬魚研究中證實在胰腺內(nèi)分泌細胞分化過程Pax6b缺失的胚胎中不會發(fā)育生成β細胞，δ細胞大量減少，ε細胞呈現(xiàn)明顯的增多。對Pax6b功能不全的胚胎適度注射Pax6b嗎琳代能夠顯著提高α細胞的數(shù)量與胰高血糖素的水平[11]。在小鼠胚胎的E10 d，Pax6表達于內(nèi)分泌祖細胞，Pax6能夠調(diào)控內(nèi)分泌激素的轉(zhuǎn)錄，能夠刺激內(nèi)分泌細胞特別是α細胞的增值。此外Pax6還能夠抑制胃饑餓素的分泌。

2.4 Nkx

2.4.1 Nkx6.1與Nkx6.2

同源異性框基因Nkx6.1與Nkx6.2在胰腺β細胞的發(fā)育與功能執(zhí)行中發(fā)揮著重要的作用。研究顯示Pdx1與Ngn3雙陽性前體細胞是內(nèi)分泌細胞共同的前體細胞群,但缺少Nkx6.1在胚胎發(fā)育時期會導(dǎo)致β細胞形成異常,而不影響胰腺中其他細胞的分化與發(fā)育[12],該研究提示β細胞分化可能也需要Nkx6.1因子在Pdx1陽性前體細胞中持續(xù)表達。Nkx6.1在成熟β細胞表達，以此維持著β細胞的正常功能，與此相比Nkx6.2僅表達于胰高血糖素與淀粉酶陽性細胞內(nèi)，在胚胎發(fā)育的E15.5 dNkx6.2的表達將會終止。在Nkx6.1缺失的突變體小鼠中胚胎發(fā)育E13 d后無胰島素陽性細胞產(chǎn)生，致使β細胞的形成降低了85%[13]。在Nkx6.1與Nkx6.2雙基因缺失的小鼠中95%的胰腺β細胞喪失，這充分的證實了Nkx6.1在胰腺β細胞發(fā)育中的作用，同時證實在胰腺祖細胞形成β細胞過程中Nkx6.2能夠代償部分Nkx6.1的功能。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在Nkx6.1基因缺失的小鼠中在含有Pdx1啟動子而無Ngn3啟動子下表達Nkx6.1或Nkx6.2能夠有效的修復(fù)β細胞的的損失。該項研究也證實了Nkx6.2能夠代償Nkx6.1的功能[14]。

小鼠中研究證實Nkx6在胰腺α細胞與β細胞的分化中扮演著重要的角色。Binot等在斑馬魚中研究證實Nkx6.1與Nkx6.2共表達于胰腺初級內(nèi)分泌祖細胞內(nèi)，但是他們表達的層次不同，Nkx6.1主要表達于形成胰島的腹側(cè)，Nkx6.2主要表達與胰腺β細胞內(nèi)。在斑馬魚中敲除Nkx6.1或Nkx6.2則表現(xiàn)為α細胞的完全缺失，而對β細胞，δ細胞和ε細胞沒有產(chǎn)生影響。Nkx6.1或Nkx6.2全部敲除時則表現(xiàn)為β細胞會呈現(xiàn)劇烈的減少[15]。

Nkx6.1與Nkx6.2在胚胎的E9.5 d表達于所有的上皮細胞。E11-E13天Nkx6.1表達于所有Pdx1陽性細胞，但是Nkx6.2不表達。Nkx6.2在胚胎發(fā)育的E15 d表達于腺細胞與部分胰高血糖素素細胞內(nèi)。Pdx1陽性細胞在Nkx6.1與Nkx6.2調(diào)控下才能轉(zhuǎn)化為胰腺β細胞。Nkx6.1是β細胞成熟與增值必不可少的一個調(diào)控因子。在α細胞的發(fā)育過程中Nkx6.1與Nkx6.2也是必不可少的調(diào)控因子。

2.4.2 Nkx2.2

Nkx2.2最先表達于胚胎發(fā)育的E9.5 d，至E10.5 d半數(shù)胰腺上皮細胞均有Nkx2.2的表達，在以后的發(fā)育階段中Nkx2.2主要表達于除δ細胞的Ngn3陽性細胞內(nèi)。值得注意的是在Nkx2.2缺失的小鼠中無胰腺β細胞的產(chǎn)生，α細胞減少80%，PP細胞適量減少，δ細胞不能執(zhí)行正常生理功能[16]。有研究證實Nkx2.2能夠結(jié)合與激活MafA基因從而對胰腺β細胞的分化與形成起到重要的作用[17]。在斑馬魚研究中證實Nkx2.2能夠增強導(dǎo)管細胞的形成。

2.5 ArX

磺胺異二甲嘧啶相關(guān)同源異型盒(Arx)基因首先是在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的。最初在E9.5 d胰腺上皮細胞中表達，Arx的表達限制了胰腺內(nèi)分泌細胞的類型。如果Ngn3敲除則不會表達Arx，這證實Ngn3是位于Arx上游的基因。Arx在形成α、β、δ與pp細胞正常的比例中起到重要的作用。當Arx基因缺失時，δ細胞數(shù)量會明顯增高，α細胞明顯減少[18]。Arx基因主要是促進α細胞的分化并且抑制β與δ細胞的分化，Arx與Pax蛋白的相互抑制作用，在Arx基因缺失的突變小鼠中無α細胞的分化，α前體細胞傾向于轉(zhuǎn)化為β與δ細胞[19]。與此相反在Pdx1陽性細胞中Arx基因過表達則會使β與δ前體細胞傾向于轉(zhuǎn)化為α與PP細胞。

2.6 MafA與MafB

Maf蛋白屬于巨噬細胞激活因子(macrophage-activating factor, Maf)家族，是API家族在胚胎發(fā)育和腫瘤生成中發(fā)揮不同功能的一種基本的亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子(bZIP)。

MafA是v-maf原癌基因家族的成員,是唯一特異存在于胰島β細胞的轉(zhuǎn)錄因子。在胚胎形成時期,MafA與MafB共同表達于胰島素陽性的β細胞,而在成人胰腺中,僅MafA表達于β細胞, 參與調(diào)節(jié)胰島素合成、分泌和糖代謝等相關(guān)基因的表達。MafA蛋白的分布和其他轉(zhuǎn)錄因子有所不同，它是β細胞胰島素基因活化轉(zhuǎn)錄因子，胰腺β細胞的成熟和功能的維持都有賴于MafA蛋白的正常表達。MafA不是β細胞形成所必須的一轉(zhuǎn)錄因子，但卻是β細胞作為胰島素調(diào)控基因功能的必需因子。MafA在血糖調(diào)節(jié)胰島素基因表達的過程中發(fā)揮著重要作用,葡萄糖濃度的變化可在多個水平調(diào)節(jié)MafA的表達水平及功能活性。在糖尿病狀態(tài)下,MafA 的表達和( 或 )活性減低,抑制了胰島素的生物合成和分泌。MafA與胰島素陽性細胞是從MafB與胰島素陽性祖細胞分化而來的[20]。在第二次細胞躍遷中MafA首先表達于胰島素陽性細胞內(nèi)。當β細胞從未成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)化為成熟的細胞后，MafB將終止表達。在MafB基因缺失的突變體中胰島素陽性細胞與胰高血糖素陽性細胞的發(fā)育將會延遲，并且這兩種細胞的數(shù)量將會減少50%，這些研究證實MafB是調(diào)控α、β細胞成熟的一個重要因子。

3 胰島β細胞發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用

近年來，人們利用與胰島發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子將胰腺干細胞定向分化為β細胞，或?qū)⒎且葝u素分泌細胞轉(zhuǎn)分化為胰島素或類胰島素分泌細胞，這在糖尿病治療方面表現(xiàn)出了巨大的潛力。

構(gòu)建含有Pdx1基因的真核表達載體，轉(zhuǎn)染介質(zhì)Superfect介導(dǎo)重組載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)，能增強大鼠MSCs體外分化為功能性胰島素分泌細胞的能力，對開展胰島移植治療1型糖尿病有重要價值[21]。經(jīng)Ngn3蛋白誘導(dǎo)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞出現(xiàn)細胞聚集生長現(xiàn)象，并有形狀類似胰島β的細胞團出現(xiàn)[22]。

胰島的發(fā)育是許多轉(zhuǎn)錄因子在時空上選擇性表達的結(jié)果, 通常用一種轉(zhuǎn)錄因子并不能將非β細胞很好地誘導(dǎo)分化為成熟的、能夠替代β細胞的胰島素分泌細胞, 因此, 目前的常用方法是將幾種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子共轉(zhuǎn)染非β細胞, 使其定向分化為成熟的β細胞。如構(gòu)建含 Pdx1與Nkx6.1雙基因的重組腺病毒載體，用該載體分別感染人胎肝間充質(zhì)干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)，并聯(lián)合相應(yīng)的細胞因子分步誘導(dǎo)，研究顯示誘導(dǎo)后的細胞能夠持續(xù)穩(wěn)定的表達胰島素。胰島β樣細胞移植能有效恢復(fù)STZ糖尿病小鼠的血糖正常水平,維持小鼠良好的生存狀態(tài)[23-24]。Pdx1與Ngn3協(xié)同作用誘導(dǎo)肝實質(zhì)細胞向胰腺β樣細胞分化，證實Pdx1與Ngn3雙基因聯(lián)合在誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)分化為β樣細胞方面具有協(xié)同作用, 可啟動部分β細胞功能相關(guān)的基因表達，具體機制尚不清楚[25]。胰島素轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵調(diào)控因子Pdx1，神經(jīng)分化因子1(NeuroD1)和MafA三者能協(xié)同作用使小鼠iPS細胞分化為具有顯著胰島素合成和分泌能力的胰島素分泌細胞[26]。Ngn3與Pax4對Pdx1誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向胰腺分泌細胞分化具有促進作用[27]。

盡管通過廣泛的研究，已經(jīng)明確了胰腺發(fā)育的形態(tài)學(xué)標志，但是我們只是剛剛才開始了解負責決定胰腺細胞命運的眾多調(diào)節(jié)因子和細胞間信號分子。胰腺β細胞發(fā)育的基因轉(zhuǎn)錄是一個具有等級或級聯(lián)反應(yīng)的過程，每一個階段都不是單獨的基因在起作用，而是很多基因共同作用的結(jié)果。了解胰腺細胞的發(fā)育機制可以更好地控制其再生，更加準確地誘導(dǎo)胰腺細胞的發(fā)育，從而應(yīng)用于胰腺組織的再生研究以及糖尿病的臨床治療。但要使誘導(dǎo)形成的胰島素分泌細胞達到臨床治療的要求，還需解決許多的問題。目前，利用轉(zhuǎn)錄因子將非β細胞誘導(dǎo)為胰島素分泌細胞的研究時間較短，其分子機制尚不清楚，誘導(dǎo)形成β細胞的比率低，且不成熟；人為導(dǎo)入這些轉(zhuǎn)錄因子，是否會引起細胞的其他癌變；誘導(dǎo)形成的胰島素分泌細胞是否同樣會遭到免疫攻擊，這類問題尚無定論。但隨著胰島β細胞發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子研究的深入，必將為糖尿病的治療提供更為廣闊前景。

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