肖 邦，崔淑芳

(第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，上海 200433)

1 生物節(jié)律概述

1.1 生物鐘的組成

生物節(jié)律是指機(jī)體的活動(dòng)隨時(shí)間的變化所表現(xiàn)出來(lái)的規(guī)律，主要有日節(jié)律、月節(jié)律、年節(jié)律等。其中，我們平時(shí)所說(shuō)的節(jié)律一般是日節(jié)律又稱(chēng)晝夜節(jié)律。節(jié)律生物鐘由三部分組成：校準(zhǔn)時(shí)間的輸入途徑、產(chǎn)生節(jié)律信號(hào)的中央振蕩器、影響生理及行為節(jié)律的輸出途徑。在大部分的生物體，包括哺乳動(dòng)物，光周期是起節(jié)律誘導(dǎo)作用的最主要環(huán)境因素。視網(wǎng)膜的光感受器細(xì)胞感知的光信號(hào)通過(guò)一條被稱(chēng)為視網(wǎng)膜下丘腦的路徑傳遞給視交叉上核(SCN)的神經(jīng)元。SCN內(nèi)含有哺乳動(dòng)物最主要的振蕩器起搏點(diǎn)。

除了SCN的中樞起搏器外，其它外周組織諸如心臟、肝、腎、胚胎組織和孤立的細(xì)胞中內(nèi)在振蕩器在也相繼被發(fā)現(xiàn)[1-2]，由此認(rèn)為自主節(jié)律生物鐘在機(jī)體的每個(gè)細(xì)胞中都存在?？茖W(xué)家構(gòu)建生物鐘基因(PERIOD2)與熒光素酶融合蛋白(PERIOD2：LUC)來(lái)研究小鼠生物節(jié)律的動(dòng)力學(xué)特征發(fā)現(xiàn)，外周組織在離體的情況下具有保持節(jié)律震蕩超過(guò)20個(gè)循環(huán)的能力。并且，外周器官在生物節(jié)律的周期長(zhǎng)度和時(shí)相上具有組織特異性[3]。

1.2 生物鐘的分子機(jī)制

無(wú)論是中樞生物鐘還是外周生物鐘，振蕩器是其最為關(guān)鍵的部分，它是由一組呈近日節(jié)律表達(dá)的基因(CLOCK、BMAL1、PER、CRY、DEC等)及其編碼的蛋白質(zhì)(CLOCK、BMAL1、PER、CRY、DEC等)組成。在這個(gè)振蕩器中異二聚體轉(zhuǎn)錄因子CLOCK-BMAL1驅(qū)動(dòng)PER和CRY的自身抑制因子PER和CRY蛋白的表達(dá)。CLOCK-BMAL1的再活化發(fā)生在PER和CRY蛋白更新幾個(gè)小時(shí)之后[4]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TRAP150(甲狀腺激素受體相關(guān)蛋白150)是CLOCK-BMAL1的激活因子，其把CLOCK-BMAL1與靶基因啟動(dòng)子聯(lián)系起來(lái)，可以促進(jìn)CLOCK-BMAL1與靶基因的結(jié)合[5]。Cao等[6]證明，機(jī)體通過(guò)mTOR/4E-BP1信號(hào)通路對(duì)SCN生物鐘傳輸及同步化過(guò)程進(jìn)行調(diào)控?？茖W(xué)家最新的研究發(fā)現(xiàn)，真核生物生物節(jié)律的保持存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控循環(huán)之外的機(jī)制—氧化還原平衡節(jié)律[7]。進(jìn)一步的研究證實(shí)在生物進(jìn)化的過(guò)程中過(guò)氧化物酶蛋白是保守的生物鐘標(biāo)志分子[8]。

2 體外培養(yǎng)細(xì)胞的生物節(jié)律

2.1 視交叉上核神經(jīng)元細(xì)胞生物節(jié)律

SCN內(nèi)含有哺乳動(dòng)物最主要的振蕩器起搏點(diǎn)，體外培養(yǎng)的SCN神經(jīng)元的神經(jīng)沖動(dòng)發(fā)放頻率同樣保持節(jié)律性。研究人員通過(guò)微陣列法體外培養(yǎng)新生大鼠SCN神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，單個(gè)SCN神經(jīng)元具有維持自主節(jié)律性震蕩幾天或幾周的潛能；同時(shí)，可逆性地阻斷神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)沖動(dòng)發(fā)放2.5 d后，還具有節(jié)律性，而且阻斷前后其生物節(jié)律的相位沒(méi)有發(fā)生改變[9]。另外，研究還發(fā)現(xiàn)一個(gè)培養(yǎng)單元中的神經(jīng)元細(xì)胞盡管具有許多功能性的突觸，但是每個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞表現(xiàn)出的節(jié)律性行為并不是同步的；進(jìn)一步的研究顯示，體外培養(yǎng)的SCN神經(jīng)元細(xì)胞系(SCN2.2細(xì)胞)不僅表現(xiàn)出生物鐘基因(PER)表達(dá)的節(jié)律性而且其內(nèi)源性的2-脫氧葡萄糖攝取行為也同樣具有節(jié)律性[10]。

2.2 其他神經(jīng)元細(xì)胞生物節(jié)律

除了SCN神經(jīng)元細(xì)胞外，高等生物體的其他神經(jīng)組織細(xì)胞(如視網(wǎng)膜細(xì)胞、松果體細(xì)胞)在體外培養(yǎng)的條件下同樣表現(xiàn)出節(jié)律性的生理性活動(dòng)(如褪黑色素分泌)。例如，倉(cāng)鼠的視網(wǎng)膜及雞的松果體細(xì)胞在體外培養(yǎng)的條件下，其分泌褪黑色素的活動(dòng)具有晝夜節(jié)律性：在持續(xù)黑暗的條件下，褪黑色素至少可以持續(xù)5個(gè)24 h周期性釋放[11]。Leonardo等[12]選擇8日齡雞胚的原代視網(wǎng)膜細(xì)胞來(lái)研究細(xì)胞中黑素蛋白基因OPN4X、OPN4M，生物鐘基因CLOCK、PER2，乙酰基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)類(lèi)型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在持續(xù)黑暗(DD)條件下細(xì)胞中上述所檢測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄無(wú)節(jié)律性；而在12 h光照：12 h黑暗(12 L:12 D)的條件下，CLOCK、PER2、OPN4M、乙酰基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄具有節(jié)律性；并且對(duì)于松果體細(xì)胞，這種周期活動(dòng)會(huì)隨著光照周期的變化而發(fā)生時(shí)相遷移，如在12 L：12 D光照周期下，提前或延遲光照6 h都會(huì)使細(xì)胞的褪黑色素釋放節(jié)律發(fā)生相應(yīng)的時(shí)相遷移。由此認(rèn)為，體外培養(yǎng)細(xì)胞的光感受器可以介導(dǎo)細(xì)胞生物節(jié)律根據(jù)光周期的變化而發(fā)生相應(yīng)的時(shí)相遷移[13]。

2.3 成纖維細(xì)胞生物節(jié)律

體內(nèi)無(wú)論是中樞SCN還是外周組織器官都有生物節(jié)律震蕩器的存在，并且體外培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞依然保持著節(jié)律震蕩的特性，后續(xù)研究證實(shí)體外培養(yǎng)的外周組織細(xì)胞同樣也具有生物節(jié)律。研究人員在對(duì)大鼠成纖維細(xì)胞(rat-1成纖維細(xì)胞)的研究中發(fā)現(xiàn)，血清休克可對(duì)rat-1成纖維細(xì)胞生物鐘基因(C-fos和Rper)的表達(dá)造成短暫刺激，而且生物鐘基因這種刺激性表達(dá)可以很好地模擬體內(nèi)SCN光誘導(dǎo)生物鐘基因的表達(dá)。另外還發(fā)現(xiàn)，體外rat-1成纖維細(xì)胞生物鐘基因短暫的刺激性表達(dá)與體內(nèi)肝臟生物鐘基因的表達(dá)相類(lèi)似[14]。

2.4 干細(xì)胞生物節(jié)律

干細(xì)胞作為一種尚未分化的組織細(xì)胞，以其為模型研究生物鐘隨著細(xì)胞分化而發(fā)生變化對(duì)于了解生物鐘的發(fā)生、發(fā)展具有特殊的應(yīng)用意義。Inada等[15]的研究證實(shí)，原代分離的胚胎干細(xì)胞和來(lái)源于轉(zhuǎn)基因小鼠(Per2：Luc小鼠)胚胎的唾液腺細(xì)胞的生物鐘基因表達(dá)節(jié)律性在體外培養(yǎng)的條件會(huì)隨著胚胎的發(fā)育而發(fā)生改變：細(xì)胞的生物鐘可以被重編程因子重新編程。另外，Tsinkalovsky等[16]也發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的造血干細(xì)胞生物鐘基因的表達(dá)也會(huì)隨著細(xì)胞的分化而發(fā)生改變。在干細(xì)胞除了生物鐘基因的表達(dá)會(huì)隨著細(xì)胞分化而發(fā)生改變外，細(xì)胞的其他活動(dòng)(如葡萄糖吸收)的節(jié)律特征也同樣會(huì)發(fā)生改變。Paulose等[17]研究發(fā)現(xiàn)，未分化的干細(xì)胞表現(xiàn)出吸收葡萄糖的節(jié)律性而時(shí)鐘基因的表達(dá)沒(méi)有節(jié)律性；而干細(xì)胞分化后，在所檢測(cè)的生物鐘基因中部分時(shí)鐘基因呈現(xiàn)節(jié)律性表達(dá)，并且細(xì)胞葡萄糖吸收的節(jié)律振幅幅度增強(qiáng)。

2.5 其他外周細(xì)胞生物節(jié)律

研究較多且成熟的體外培養(yǎng)細(xì)胞模型可以使我們對(duì)生物鐘的了解更加深入，但是，卻不夠全面，對(duì)其他細(xì)胞模型的研究可以很好地解決這個(gè)問(wèn)題。研究人員利用血清誘導(dǎo)兩種不同來(lái)源(血小板來(lái)源、頸動(dòng)脈來(lái)源)的血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)后發(fā)現(xiàn)，兩種來(lái)源細(xì)胞的生物鐘基因(CRY1,CRY2,PER1,PER2,PER3和REV-ERBA)呈現(xiàn)明顯的節(jié)律性表達(dá)。值得注意的是，CLOCK在血小板來(lái)源的VSMCs中節(jié)律性表達(dá)，而在頸動(dòng)脈來(lái)源的VSMCs中沒(méi)有呈現(xiàn)節(jié)律性表達(dá)；并且與頸動(dòng)脈來(lái)源的VSMCs相比，血小板來(lái)源的VSMCs中這些時(shí)鐘基因(CRY1,CRY2,PER1,PER2,PER3和REV-ERBA)的表達(dá)顯著減弱[18]，這一結(jié)果提示不同種類(lèi)或者來(lái)源的外周細(xì)胞維持生物節(jié)律的分子機(jī)制可能不同。

3 體外培養(yǎng)細(xì)胞生物節(jié)律的相關(guān)機(jī)制

3.1 體外培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞生物節(jié)律的相關(guān)機(jī)制

3.1.1 神經(jīng)元之間通過(guò)接觸連接的方式來(lái)影響生物節(jié)律的維持

基于體外培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出令人驚奇的生物節(jié)律，科學(xué)家深入地探索了細(xì)胞維持其生物節(jié)律的分子機(jī)制。研究人員通過(guò)在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中引入示蹤分子(神經(jīng)生物肽)以及采用對(duì)細(xì)胞縫隙連接分子—特異性連接蛋白進(jìn)行免疫標(biāo)記的方法來(lái)對(duì)體外培養(yǎng)的SCN細(xì)胞之間的縫隙連接在其生物節(jié)律產(chǎn)生中的作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：星型膠質(zhì)細(xì)胞相互之間通過(guò)連接蛋白廣泛地連接，而神經(jīng)元細(xì)胞之間以及神經(jīng)元細(xì)胞與星型膠質(zhì)細(xì)胞之間并沒(méi)有縫隙連接的存在。這一結(jié)果支持了體外培養(yǎng)的SCN神經(jīng)元細(xì)胞自主發(fā)放節(jié)律性神經(jīng)沖動(dòng)是單個(gè)細(xì)胞的節(jié)律性行為的假設(shè)[19]。研究進(jìn)一步證明，生物鐘基因(PER1、PER2和CRY1)是維持SCN神經(jīng)元細(xì)胞生物節(jié)律的必須基因，而另外的兩個(gè)生物鐘基因(CRY2和PER3)的失活僅僅引起了細(xì)胞生物節(jié)律周期長(zhǎng)度的改變[20]。

3.1.2 神經(jīng)元之間通過(guò)分泌多巴胺來(lái)影響生物節(jié)律的維持

神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺及其受體(D1、D2、D4、D5受體)在神經(jīng)元之間的聯(lián)系過(guò)程中扮演著極其重要的角色。那么，神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺在神經(jīng)元細(xì)胞生物鐘的維持中是否同樣也有其重要意義？為此，科學(xué)家進(jìn)行了一系列相關(guān)研究。研究人員發(fā)現(xiàn)，加入到培養(yǎng)基的多巴胺、多巴胺受體激動(dòng)劑或者抑制劑對(duì)在33℃下培養(yǎng)了24 h的神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞的褪黑色素釋放活動(dòng)具有顯著影響：濃度為0.1 μmol/L的多巴胺對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞褪黑色素的釋放沒(méi)有抑制作用，而高濃度的(1～1000 μmol/L)多巴胺卻可以以劑量依賴(lài)的方式抑制褪黑色素的釋放。而且實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，多巴胺的這種作用受多巴胺受體(D2/D4受體)介導(dǎo)，D2和D4受體激動(dòng)劑(100 μmol/L)可抑制褪黑色素的釋放，D2/D4選擇性受體拮抗劑(100 μmol/L)與多巴胺一起加入到培養(yǎng)基可以阻斷多巴胺對(duì)褪黑色素釋放的抑制作用。從而推斷在哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜細(xì)胞中多巴胺可能抑制其褪黑色素的釋放，而且這種作用可能是由D2/D4多巴胺能受體介導(dǎo)[21]。

3.1.3 功能性生物鐘的同步化需要谷氨酸鹽的誘導(dǎo)

影響細(xì)胞生物節(jié)律的神經(jīng)遞質(zhì)除了多巴胺外，其他神經(jīng)遞質(zhì)(例如谷氨酸鹽)在細(xì)胞生物鐘同步化的誘導(dǎo)過(guò)程中亦發(fā)揮重要作用。Leonardo等[12]證明，在持續(xù)黑暗(DD)條件下，谷氨酸鹽能夠誘導(dǎo)CLOCK基因的節(jié)律性表達(dá)，并可強(qiáng)烈地抑制黑素蛋白基因(OPN4X、OPN4M)的表達(dá)，而對(duì)生物鐘基因(PER2)及乙?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄并未產(chǎn)生影響。因此Leonardo推斷功能性生物鐘的同步化需要谷氨酸鹽的誘導(dǎo)。以上的研究表明，神經(jīng)元細(xì)胞之間通過(guò)分泌某些信號(hào)物質(zhì)(例如多巴胺、谷氨酸鹽)或者接觸連接的方式來(lái)影響生物節(jié)律的維持。

3.1.4 其他影響神經(jīng)元細(xì)胞生物節(jié)律的分子機(jī)制

目前，傳統(tǒng)的神經(jīng)元細(xì)胞生物節(jié)律產(chǎn)生及維持機(jī)制無(wú)法完全解釋某些現(xiàn)象。因此，科學(xué)家們開(kāi)始嘗試從新的方向來(lái)闡明其他相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。Rodriguez等[22]近期研究發(fā)現(xiàn)，不同的生物鐘調(diào)節(jié)性輸入途徑驅(qū)動(dòng)相同的神經(jīng)活動(dòng)節(jié)律。另外，該小組還發(fā)現(xiàn)，相同的離子電流在不同的條件下扮演不同的角色，而不同的電流在相同的條件下也可以扮演相同的角色。據(jù)此，Rodriguez開(kāi)創(chuàng)了一個(gè)研究生物鐘機(jī)制及其功能調(diào)節(jié)的新方向。

3.2 體外培養(yǎng)外周組織細(xì)胞生物節(jié)律相關(guān)機(jī)制

3.2.1 體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞生物節(jié)律相關(guān)機(jī)制

3.2.1.1 神經(jīng)元的可擴(kuò)散信號(hào)影響成纖維細(xì)胞的代謝活動(dòng)及per基因表達(dá)

與體內(nèi)SCN神經(jīng)元細(xì)胞相似，體外培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞同樣具有分泌信號(hào)物質(zhì)來(lái)控制外周組織細(xì)胞生物鐘的功能。研究人員證實(shí)，體外培養(yǎng)的SCN神經(jīng)元細(xì)胞系(SCN2.2細(xì)胞)通過(guò)分泌可擴(kuò)散信號(hào)物質(zhì)(如多巴胺)使與其共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞(NIH/3T3細(xì)胞)的代謝活動(dòng)及PER基因表達(dá)產(chǎn)生節(jié)律性特征：NIH/3T3細(xì)胞所獲得節(jié)律的時(shí)相較SCN2.2細(xì)胞的節(jié)律晚4～12 h，這和體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的SCN與外周組織之間的時(shí)相關(guān)系相似。而且NIH/3T3細(xì)胞生物節(jié)律的保持依賴(lài)于SCN2.2細(xì)胞持續(xù)的特異性信號(hào)輸出：通過(guò)血清震蕩來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生生物節(jié)律的細(xì)胞不能驅(qū)動(dòng)與其共培養(yǎng)的非處理細(xì)胞生物鐘基因(PER1和PER2)的節(jié)律性表達(dá)。這表明PER、CRY的節(jié)律性表達(dá)不足以充當(dāng)起搏器的角色。因此，SCN神經(jīng)元細(xì)胞特異性的信號(hào)輸出對(duì)于驅(qū)動(dòng)外周組織細(xì)胞生物節(jié)律是必須的[10]。

3.2.1.2 成纖維細(xì)胞生物節(jié)律基因的表達(dá)需要周?chē)?xì)胞的旁分泌信號(hào)支持

神經(jīng)元細(xì)胞的可擴(kuò)散信號(hào)可以影響與其共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的生物節(jié)律，另有研究證實(shí)，成纖維細(xì)胞生物鐘基因的節(jié)律性表達(dá)同樣需要周?chē)巧窠?jīng)元細(xì)胞旁分泌信號(hào)的支持，而且這種旁分泌信號(hào)并不需要具有節(jié)律性。而且，周?chē)渌憩F(xiàn)出生物節(jié)律的節(jié)律性信號(hào)并不會(huì)對(duì)成纖維細(xì)胞的原有生物節(jié)律(周期和時(shí)相)產(chǎn)生影響[23]。

3.2.1.3 細(xì)胞內(nèi)環(huán)境可以對(duì)生物鐘基因表達(dá)水平之間的差異進(jìn)行補(bǔ)償

在機(jī)體的幾乎所有的細(xì)胞中，生物鐘都是由生物鐘基因的節(jié)律性轉(zhuǎn)錄環(huán)路來(lái)驅(qū)動(dòng)的。Matsumura等[24]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞特異性的內(nèi)環(huán)境也會(huì)對(duì)生物鐘產(chǎn)生影響。他們發(fā)現(xiàn)，生物鐘基因表達(dá)時(shí)相相互之間的關(guān)系在外周組織是相似的，然而同一生物鐘基因的表達(dá)水平在組織之間的差異卻可達(dá)三倍之多。同時(shí)，他們還發(fā)現(xiàn)，使用不同濃度血清來(lái)培養(yǎng)成纖維細(xì)胞并不會(huì)對(duì)其生物鐘基因的表達(dá)產(chǎn)生顯著性的影響。據(jù)此可以推斷細(xì)胞內(nèi)環(huán)境(例如氧化還原反應(yīng)潛能、代謝物的成分等)可以對(duì)生物鐘基因表達(dá)水平的差異進(jìn)行定量的補(bǔ)償。

3.2.1.4 功能性的CRY基因?yàn)槌衫w維細(xì)胞產(chǎn)生生物節(jié)律所必須

外來(lái)的信號(hào)是通過(guò)影響細(xì)胞固有的生物鐘基因以及生物鐘控制的相關(guān)基因來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生物節(jié)律的，只有闡明固有生物鐘及其相關(guān)基因，才能真正認(rèn)識(shí)其內(nèi)在的分子機(jī)制。研究者采用來(lái)源于轉(zhuǎn)基因小鼠(CRY突變小鼠)的細(xì)胞(CRY突變細(xì)胞系)以及野生型細(xì)胞對(duì)比研究體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞生物鐘分子機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，CRY蛋白調(diào)控著細(xì)胞生物節(jié)律周期的時(shí)間長(zhǎng)度，細(xì)胞如缺失功能性的CRY基因，則不能產(chǎn)生生物節(jié)律[25]，從而初步確定CRY是成纖維細(xì)胞的固有生物鐘基因。

3.2.1.5BMAL1的O連接N-乙酰葡糖胺糖基化調(diào)節(jié)NIH3T3成纖維細(xì)胞生物節(jié)律

雖然說(shuō)環(huán)境信號(hào)及細(xì)胞內(nèi)部代謝過(guò)程在協(xié)調(diào)和整合24 h的生物節(jié)律過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，但是翻譯后修飾在調(diào)節(jié)生物鐘關(guān)鍵蛋白中也扮演著重要角色。Li等[26]發(fā)現(xiàn)，BMAL1存在O連接N-乙酰葡糖胺糖基化修飾，這種修飾可以使其穩(wěn)定并且增強(qiáng)其的轉(zhuǎn)錄活性。而抑制BMAL1 O連接N-乙酰葡糖胺糖基化會(huì)導(dǎo)致生物鐘基因節(jié)律性表達(dá)降低?；贠連接N-乙酰葡糖胺糖基化作用對(duì)葡萄糖水平敏感，Li認(rèn)為此種修飾可能是連接機(jī)體代謝與生物節(jié)律的新機(jī)制。

3.2.1.6 組織特異性的PER1/2 和DEC2的相互作用調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生物節(jié)律

在動(dòng)物體內(nèi)，細(xì)胞生物鐘基因突變而引發(fā)的表型變化可以被細(xì)胞間的偶聯(lián)機(jī)制所掩蓋，從而穩(wěn)定細(xì)胞的生物節(jié)律。Tsang等[27]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞生物鐘基因PER和DEC2相互作用的主要方式是協(xié)同作用：細(xì)胞在缺失PER2的情況下，DEC2使其生物鐘不穩(wěn)定，并且這種作用具有組織特異性。同時(shí)敲除細(xì)胞的PER1和DEC2或PER2和DEC2發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出生物節(jié)律的能力大大降低，從而得出DEC2與PER相互作用來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞生物節(jié)律周期的結(jié)論。

3.2.2 外周組織在細(xì)胞和組織的水平上存在著組織特異的節(jié)律震蕩同步化因子

研究人員發(fā)現(xiàn)SCN中PER2基因的損傷并沒(méi)有使外周組織的生物節(jié)律消失，而只是引起了動(dòng)物體組織之間或者是個(gè)體之間的生物節(jié)律時(shí)相不一致。由此研究人員一致認(rèn)為，外周組織具有自主保持生物節(jié)律的震蕩器，同時(shí)在細(xì)胞和組織的水平上存在著組織特異的節(jié)律震蕩同步化因子[3]。

3.2.3 細(xì)胞間的相互作用或者腫瘤樣微環(huán)境影響腫瘤細(xì)胞生物節(jié)律

另外，基于前人在研究中的發(fā)現(xiàn)：富含腫瘤干細(xì)胞(CSCs)的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生物鐘基因(如PER)的表達(dá)具有晝夜節(jié)律性，并且這些生物鐘基因在缺乏所有生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基條件下表達(dá)節(jié)律性特別的明顯，Sharma等[28]采用了一種鑒定單個(gè)CSCs的方法用于單個(gè)細(xì)胞節(jié)律性行為的分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單層培養(yǎng)的CSCs的Per蛋白的行為—細(xì)胞核內(nèi)定位不具有節(jié)律性，所以他們推測(cè)細(xì)胞間的相互作用或者是腫瘤樣微環(huán)境能使腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出節(jié)律性行為。

3.2.4 外周組織細(xì)胞生物節(jié)律的其他機(jī)制

不同的組織細(xì)胞通過(guò)合成和分泌不同的信號(hào)物質(zhì)來(lái)執(zhí)行不同的生物學(xué)功能，所以生物節(jié)律調(diào)節(jié)也會(huì)存在不同的信號(hào)機(jī)制。Bernat等[29]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)性營(yíng)養(yǎng)因子受體(P75NTR)可以改變時(shí)鐘基因在成纖維細(xì)胞的震蕩節(jié)律。而在另外一項(xiàng)外周破骨細(xì)胞的研究顯示，糖皮質(zhì)激素通過(guò)介導(dǎo)外周破骨細(xì)胞的生物節(jié)律而導(dǎo)致破骨細(xì)胞相關(guān)基因的節(jié)律性表達(dá)：糖皮質(zhì)激素可以使體外培養(yǎng)的破骨細(xì)胞時(shí)鐘基因和破骨相關(guān)基因的節(jié)律性表達(dá)明顯同步化[30]。Okamura等[31]最近還發(fā)現(xiàn)抑制細(xì)胞生物鐘基因的甲基化作用可以使小鼠胚胎成纖維細(xì)胞生物節(jié)律的周期延長(zhǎng)。

盡管如此，人們對(duì)外周培養(yǎng)細(xì)胞生物節(jié)律產(chǎn)生及維持機(jī)制的了解也僅僅是在外周信號(hào)影響和調(diào)節(jié)以及少數(shù)相關(guān)基因以及他們的產(chǎn)物上，而對(duì)于信號(hào)物質(zhì)是如何影響和調(diào)節(jié)細(xì)胞固有生物鐘基因表達(dá)，特別是對(duì)其里面所包含的確切信號(hào)通路以及由通路構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，目前尚不清楚，并且組織特異時(shí)鐘基因的表達(dá)也不盡相同。因此，對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞特別是外周組織細(xì)胞生物節(jié)律還需要更加深入、全面的研究。

4 展望

越來(lái)越多的研究表明，體外培養(yǎng)的無(wú)論是中樞神經(jīng)細(xì)胞(SCN)還是周?chē)M織的體細(xì)胞(包括癌細(xì)胞)都可以表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律。而且隨著各種類(lèi)型細(xì)胞生物鐘的不斷發(fā)現(xiàn)，生物鐘節(jié)律振蕩的機(jī)制也在不斷地被闡明。借助體外培養(yǎng)手段研究生物鐘的不斷深入將會(huì)促進(jìn)人們對(duì)機(jī)體內(nèi)生物鐘復(fù)雜機(jī)制有一個(gè)更新的了解，同時(shí)通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)的結(jié)合，生物鐘的調(diào)控機(jī)制將會(huì)逐步被闡明。相信隨著研究的不斷深入，生物節(jié)律內(nèi)在的分子機(jī)制終將會(huì)被完全揭示。

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