易思萌，劉慧芳，曾 林，孫兆增，王 新

( 1. 軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，北京 100071；2.青島農(nóng)業(yè)大學，山東 青島 266109)

黑線倉鼠白化突變系的建立是為了給人類白化病提供動物模型，動物白化現(xiàn)象出現(xiàn)的原因多種多樣，關于基因突變導致白化性狀的出現(xiàn)，已經(jīng)被很多次報道，最常見的是有關于酪氨酸酶的研究，但是對于倉鼠尤其是黑線倉鼠的白化性狀的相關研究并未出現(xiàn)明確的相關研究報道[1]?？偠灾虻耐蛔儗е掳谆唵蝸碚f就是基因控制著酶，這些酶又控制著機體生化反應的過程，最后決定了動物體的性狀。但是具體是哪一部分的基因出現(xiàn)突變尚有待進一步的研究[1-2]。本文擬以肌張力異常蛋白變體X1段基因編碼區(qū)作為研究對象，依照其設計出6對引物，再通過RT-PCR的方法，試圖證明黑線倉鼠及其白化突變系肌張力異常蛋白變體X1基因編碼區(qū)之間的差異性，以及與白化現(xiàn)象是否存在聯(lián)系。肌張力異常蛋白是一種大型多域并與細胞骨架相關的蛋白質(zhì)，它在神經(jīng)系統(tǒng)中有著重要作用[3]。

肌張力異常蛋白主要分為三種亞型，分別為dystonin-e、dystonin-a、dystonin-b；其中的dystonin-a又可以通過可變剪接衍生出三種同種型神經(jīng)元，分別是dystonin-a1、dystonin-a2、dystonin-a3，肌張力異常蛋白變體X1是dystonin-a連接細胞骨架中重要的一段，以上三種同種型神經(jīng)元共享的N-末端肌動蛋白結合結構域，廣泛的卷曲螺旋區(qū)域，和一個C-末端微管結合域，從而允許用于與細胞骨架細絲相互作用并促進它們的功能，如細胞骨架連接。雖然dystonin-a同種型具有相似的域機構，但是區(qū)分他們并定位其亞細胞定位獨特性的N端區(qū)域；具體來說，dystonin-a1是一個短的N端結構域，其包括一種肌動蛋白結合結構域，其位于肌動蛋白絲，而dystonin-a2具有跨膜結構域，它定位于核膜和核周膜；dystonin-a3擁有去豆蔻?；Y構域，協(xié)助確定等離子體[4]。損失肌張力異常蛋白會導致小鼠和大鼠出現(xiàn)肌肉緊張障礙，小鼠會出現(xiàn)神經(jīng)肌肉功能障礙甚至過早死，該蛋白血小板溶素保守區(qū)域決定了該蛋白的亞型特征，但其相互作用尚未有詳細的闡述和報道[3-5]。本研究旨在明確黑線倉鼠白化突變系肌張力異常蛋白變體X1與其白化性狀產(chǎn)生機制有無影響，本實驗擬通過克隆肌張力異常蛋白變體X1段基因編碼區(qū)設計的6對引物，分析其編碼區(qū)的序列，找出可能存在的突變位點，為與黑線倉鼠及其白化突變系的相關研究，提供相應的研究數(shù)據(jù)及其理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

大腸菌株DH5a為本實驗室保存菌種。

1.1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒RNases Mini Kit為QIAGEN公司產(chǎn)品; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD18-T載體出自大連TaKaRa公司產(chǎn)品；標準分子量核酸DNA maker購自Biomed；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒是QIAGEN公司的產(chǎn)品。

1.1.3 實驗動物

黑線倉鼠及其白化突變系，體重均在19～20 g，雌性3只，5周齡。均由軍事醫(yī)學院實驗動物中心提供【SCXK(軍)2007-004】。

1.2 方法

1.2.1 黑線倉鼠及其白化突變系皮膚組織總RNA的制備

采用活體皮膚采取的方法，采取黑線倉鼠及其白化突變系背部皮膚組織30 mg用于總RNA的制備；將30 mg左右的皮膚組織剪碎移至勻漿器內(nèi)，再按照說明書的提取方法抽取總RNA，抽提的總RNA取2 uL測定A260/A280分析提取純度，之后再用甲醛變性電泳實驗分析總RNA確定提取RNA的完整性。

1.2.2 引物設計與合成

由同種型肌張力異常蛋白設計的6對引物擴增全長cDNA：

d-1-F:5’-taaacatggagacaaactga-3’；d-1-R:5’-cagcgattttctgtctcccg-3’;

d-2-F:5’-tagcctacaaaattttgaac-3’；d-2-R:5’-tatcactgaaacttccctga-3’;

d-3-F:5’-tgaggcacagtcagggaagt-3’；d-3-R:5’-gatactttggttttcatcct-3’;

d-4-F:5’-tgtaaaggaacatgaggatg-3’；d-4-R:5’-aaattggtattttctccaca-3’;

d-5-F:5’-tcttaaaagtgtggaggact-3’；d-5-R:5’-aactgcttaagctgattctt-3’;

d-6-F:5’-tctagaagctttgaagaatc-3’；d-6-R:5’-tcgtttagcttctgctcaat-3’。

1.2.3 RT-PCR

按照大連TaKaRa公司合成試劑盒提供的方法先用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA的第一條鏈，并且通過PCR擴增獲得大量的目的基因產(chǎn)物，之后再通過1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳進行分析。25 uL的PCR擴增體積中，組成該體系不同組分的濃度分別為：10×loading Buffer 2.5 uL，dNTP 4 uL，上游引物1 uL，下游引物1 uL，cDNA模板 2 uL，Lataq聚合酶0.25 uL，最后加無菌蒸餾水至25 uL。PCR運行程序為95℃欲變性5 min；95℃ 變性30 s；6對引物的退火溫度分別為d1 55℃、d2 59℃、d364℃、d4 58℃、d5 58℃、d6 61℃；72℃復性延伸2 min；35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min后終止。

1.2.4 肌張力異常蛋白cDNA的克隆及其序列測定

通過RT-PCR大量擴增出目的基因，再經(jīng)過凝膠電泳純化分離目的基因產(chǎn)物，再用QIAGEN公司的膠回收試劑盒進行產(chǎn)物的膠回收，之后再將回收的目的基因產(chǎn)物連接到pMD-18T上，16℃連接過夜后，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)里，通過菌液PCR和1.5%瓊脂糖凝膠電泳的方法篩選鑒定陽性重組，隨機挑取3個陽性克隆分別制備成菌液，送去Biomed測序。測序結果應用BLAST對其進行比較分析。

2 結果

2.1 黑線倉鼠及其白化突變系皮膚組織總RNA的制備

用RNases Mini Kit試劑盒采取黑線倉鼠及其白化突變系皮膚的總RNA，其A260/A280的值分別為2.05、1.98、1.94、1.85；1.95、1.98、2.03、1.88.，經(jīng)瓊脂糖電泳后可見較清晰的八條帶，說明所抽提的總RNA無明顯的降解，是完整的(圖1)。

注：1-4為黑線倉鼠；5-8為黑線倉鼠白化突變系。

2.2 RT-PCR獲取肌張力異常蛋白及其序列測定

以黑線倉鼠及其白化突變系皮膚總RNA為模板，進行反轉(zhuǎn)錄省去了純化mRNA的步驟。RT-PCR反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，如圖2所示，清晰可見各片段的擴增條帶產(chǎn)物，再用QIAGEN公司的膠回收試劑盒回收后，連接到質(zhì)粒pMD18-T上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)中，再經(jīng)菌液PCR鑒定成陽性。

2.3 肌張力異常蛋白的序列比對

將RT-PCR擴增得到的片段送去Biomed公司進行拼接測序，獲得了6條的包含大部分編碼區(qū)的序列，編碼6條不同片段大小的氨基酸并且利用NCBI的BLAST功能比對顯示，該序列與倉鼠的肌張力異常蛋白的基因序列具有99%的相似性，由此可知該序列與倉鼠的肌張力異常蛋白變體X1基因序列具有高度保守性，進一步證實了所分離基因的正確性，可以斷定該序列為黑線倉鼠及其白化突變系肌張力異常蛋白基因的編碼區(qū)序列。

利用DNASTAR軟件的MegAlign程序，將黑線倉鼠及其白化突變系的肌張力異常蛋白基因序列進行比對，發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)序列共6563 bp僅存在17處突變位點，翻譯成氨基酸序列共24處變化，黑:白差異點有pos=99 R:K、pos=135Y:N、pos=140 D:N、pos=442.:Q、pos=442.:Q、pos=643K:X、pos=789R:H、pos=820 D:N、pos=851 N:D、pos=856 G:S、pos=890 C:Y、pos=1034 S:P、pos=1184 W:.、pos=1269 E:G、pos=1518 L:F、pos=1528 P:S、pos=1883 L:.、pos=1884 E:R、pos=1885 A:L、pos=1886 L:.、pos=1887 K:R、pos=1888 N:I、pos=1890 Q:S、pos=1892 K:S、pos=2024 H:R；但關鍵核酸蛋白并未見突變(圖3，彩插3)。

注：A:Marker 2000；1、3、5、7、9、11：為黑線倉鼠；2、4、6、8、10：為黑線倉鼠白化突變系。

3 討論

本實驗擴增了黑線倉鼠及其白化突變系肌張力異常蛋白變體X1段較完整的基因編碼區(qū)，該序列通過NCBI的BLAST可知，其與黑線倉鼠的肌張力異常蛋白變體X1段基因序列具有99%左右的相似性，通過對該序列的數(shù)據(jù)分析和生物信息學方法，鑒定了分離基因的正確性，黑線倉鼠及其白化突變系肌張力異常蛋白變體X1段基因編碼區(qū)有與倉鼠等動物類似的結構序列，通過研究肌張力異常蛋白變體X1段基因序列，可以進一步證實該類基因是否就是影響黑線倉鼠出現(xiàn)退行性白化突變的原因，但通過對該蛋白基因片段的研究可知，我們通過RT-PCR手段擴增得出肌張力異常蛋白變體X1段基因序列并進行多態(tài)分析，進而為研究肌張力異常蛋白基因與黑線倉鼠白化性狀產(chǎn)生機制提供了相應的理論基礎。

通過DNASTAR的MegAlign軟件，分析了黑線倉鼠及其白化突變系肌張力異常蛋白基因編碼區(qū)的序列，發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)序列存在17個突變位點，翻譯成氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)24處不同，分別為：pos=99 R:K、pos=135Y:N、pos=140 D:N、pos=442.:Q、pos=442.:Q、pos=643K:X、pos=789R:H、pos=820 D:N、pos=851 N:D、pos=856 G:S、pos=890 C:Y、pos=1034 S:P、pos=1184 W:.、pos=1269 E:G、pos=1518 L:F、pos=1528 P:S、pos=1883 L:.、pos=1884 E:R、pos=1885 A:L、pos=1886 L:.、pos=1887 K:R、pos=1888 N:I、pos=1890 Q:S、pos=1892 K:S、pos=2024 H:R；但是沒有關鍵蛋白出現(xiàn)變化。說明黑線倉鼠白化突變系白化性狀產(chǎn)生的原因與該基因?qū)е碌纳窠?jīng)退行性疾病的產(chǎn)生原因不同，并不編碼區(qū)序列的突變造成的，可能是與其他基因的突變有關，黑線倉鼠白化性狀產(chǎn)生的機制仍有待進一步的研究。

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