張 賀，陳振文，王承利，孫 倩，陸 娜，王 洋

(1. 沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物科，沈陽 110015；2. 首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，北京 100669)

腦卒中，又稱腦血管意外(cerebrovascular accident，CVA)，俗稱“中風(fēng)”，是由向大腦供血的動脈血管缺血引起的一種急性疾病[1]。腦卒中給人類健康和生命造成極大威脅，給患者帶來極大痛苦，家庭及社會負(fù)擔(dān)沉重[2]。因此，為提高預(yù)防與治療水平，研究腦卒中的發(fā)病機(jī)制，找到合適的腦動脈缺血動物模型成為當(dāng)務(wù)之急[3]。

長爪沙鼠(Merionesunguiculatus，Mongolian Gerbil)是一種具有獨(dú)特生物學(xué)特性實驗動物資源[5-6]，其腦底動脈環(huán)(Willis circle)前后交通支血管缺失的遺傳特征，成為研究人類腦缺血的天然動物模型[7-8]，通過簡單的結(jié)扎方法即可獲得比大鼠、小鼠更加典型的人類腦缺血動物模型[9-11]。為了進(jìn)一步研究不同Willis環(huán)與基因表達(dá)差異的關(guān)系，建立包含全部Willis血管類型的全基因組文庫，為后續(xù)研究打下堅實基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

成年長爪沙鼠96只，雌雄各半，體重50～70 g之間，清潔級，由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部提供【SCXK(京)2010-0020】。實驗在沈陽軍區(qū)總醫(yī)院進(jìn)行【SYXK(軍)2012-002】,并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 實驗器材及主要試劑

手術(shù)器械，多功能實驗動物解剖臺 萊爾(北京)凈化設(shè)備有限公司； Library Production Kit和pCC1FOS Vector 均由EPICENTRE Biotechnologies公司提供；基因組DNA小量制備試劑盒由AxyPrep公司提供。

1.3 Copy Control Fosmid文庫的構(gòu)建

1.3.1 基因組DNA的提取

安樂死術(shù)處死動物后，快速剪下頭部，剪去顱骨，小心剝離腦組織，用生理鹽水洗去血污，置于解剖臺下觀察腦底動脈環(huán)前交通支(anterior communication arteries, ACA)和后交通支(posterior communication arteries, PCoA)的類型，剝離腦組織與血管，用苯酚氯仿法[12]從不同willis血管類型的組織中提取DNA，混合后將其溶解在TE溶液中，濃度為0.5 μg/ μL。

1.3.2 基因組DNA的剪切

取DNA溶液，至少包含2.5 μgDNA。用200 μL槍頭反復(fù)吹吸DNA 100次，使基因組DNA充分剪切。

1.3.3 基因組 DNA的末端修復(fù)

反應(yīng)體系：無菌水，2 μL；10×Buffer，8 μL；dNTP Mix，8 μL；ATP，8 μL；DNA，50 μL；End-repair enzyme Mix，4 μL；一共80 μL。

室溫下放置培養(yǎng)45 min，然后加入TE緩沖液，70℃培養(yǎng)10 min，使End-repair enzyme Mix失活。通過末端修復(fù)，可以得到平末端、5’-磷酸化的DNA。

1.3.4 連接反應(yīng)

反應(yīng)體系：無菌水，1 μL；Fast-Link 10×ligation Buffer，1 μL；PCC2Fos Cloning-ready Vector，1 μL；ATP，1 μL；DNA，5 μL；Fast-Link DNA Ligase，1 μL；一共10 μL

室溫培養(yǎng)2 h，然后將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移到70℃培養(yǎng)10 min，使Fast-Link DNA Ligase失活。

1.3.5 Copy Control Fosmid 克隆的包裝

在包裝反應(yīng)前，將過夜培養(yǎng)的宿主菌EPI300-TIR Plating Strain接種到含有10 mmol/L MgSO4的50 mL的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)。10 μL連接反應(yīng)加入25 μL已經(jīng)融化的packaging Extracts中；用移液器混勻，30℃包裝90 min，加入剩余的25 μL packaging Extracts至管中，30℃下包裝90 min。

1.3.6 Copy Control Fosmid文庫的涂布和篩選

按照每100 μLEPI300-TIR宿主菌溶液中加入10 μL稀釋后噬菌體微粒的比例將兩者混合；37℃噬菌體吸附20 min；將感染了噬菌體的細(xì)菌涂布到含有12.5 mg/mL的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)，挑選Copy Control Fosmid克隆。

1.4 基因組DNA文庫的鑒定

1.4.1 總克隆數(shù)CFU的鑒定：

取包裝產(chǎn)物10 uL感染細(xì)菌(EPI300-TIR)100 μL后，涂布LB平板(含氯霉素)，第二天計數(shù)。

總克隆數(shù)CFU=平板上的克隆數(shù)/0.01 mL×N mL

1.4.2 平均插入片段及重組率的鑒定：

隨機(jī)挑取15個克隆分別接LB液體培養(yǎng)基(含氯霉素)，搖菌后抽質(zhì)粒，并與陽性對照質(zhì)粒(約36 kb)同時跑電泳后(1%Agarose; 1.3V/cm；約12～16 h)，鑒定插入片段大小和重組率。

2 結(jié)果

2.1 不同willis血管類型

通過解剖，發(fā)現(xiàn)不同類型的willis環(huán)缺失(圖1和圖2)。

注：A：左前交通支；B：右前交通支；C：后交通支。

如圖所示，根據(jù)willis環(huán)不同程度、不同位置的缺失，共可分為前交完整，后交完整(TO4組)，前交右缺，后交完整(NO2組)，前交右缺,后交缺失(NP1組)，前交左缺，后交缺失(TO3組)，前交完整，后交缺失(CJ1組)，前交左缺，后交完整(NK組)。

2.2 基因組DNA鑒定

以36 k標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為對照組，對剪切后各組樣品基因組DNA進(jìn)行鑒定(圖3)。

2.3 總克隆數(shù)CFU的鑒定

注：A：左前交通支；B：右前交通支；C：后交通支。1：TO4組 前交完整，后交完整；2：NO2組 前交右缺，后交完整；3：NP1組 前交右缺，后交缺失；4：TO3組 前交左缺，后交缺失；5：CJ1組 前交完整，后交缺失；6：NK組 前交左缺，后交完整。

庫容鑒定瓶皿上平均克隆數(shù)為17個，平板上的CFU/ml=17/0.01 mL。總克隆CFU=平板上的CFU/mL× mL=1700×1=1700(圖4)。

注：1：36K對照；2：NO2組；3：CJ1組；4：NK組；5：TO4組；6：TO3組。

圖4 總克隆數(shù)CFU的鑒定圖

2.4 鑒定平均插入片段及重組率

以36K標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為對照，進(jìn)行電泳。平均插入片段>30 kb，約36 kb左右。隨機(jī)挑選15個克隆株，其中14個含有重組片段，重組率約93%(圖5)。

3 討論

3.1 長爪沙鼠willis circle的特點(diǎn)

長爪沙鼠是我國特有的一種小型草原動物，易于獲得，大小適宜，具有獨(dú)特的腦血管遺傳特征，是一種很好的人類腦缺血疾病模型動物。[1, 13-14]與大小鼠等嚙齒類動物腦底動脈分布不同，長爪沙鼠小腦上動脈與大腦后動脈之間缺少明顯的后交通動脈，不能構(gòu)成完整的Willis環(huán)，并有1/3以上缺失前交通動脈或前交通動脈一個組成根很細(xì)，利用此解剖學(xué)特征，結(jié)扎動物的一側(cè)頸動脈，可導(dǎo)致該側(cè)大腦半球缺血，從而獲得典型的人類腦缺血動物模型，其依據(jù)即為聯(lián)系大腦兩個半球的腦底動脈前交通支和溝通基底動脈和大腦后動脈的后交通支均存在著不同程度的缺失，結(jié)扎單側(cè)或雙側(cè)頸總動脈均能造成不同程度的腦缺血，而不像用其他動物制備該模型時必須同時切斷頸總和基底動脈兩個系統(tǒng)的供血途徑，才能制備出有效的腦缺血模型[15]。用單側(cè)結(jié)扎的方法更有諸多好處，首先是可以進(jìn)行同體對照，即同一個腦的兩個半球(一側(cè)缺血，另一側(cè)不缺血)進(jìn)行組織學(xué)比較，比使用不同個體做對照更準(zhǔn)確和方便；其次，移開動脈夾就可以逆轉(zhuǎn)腦缺血或進(jìn)行再灌注，即使不用進(jìn)行再灌注動物也可以存活較長的時間，從而使這種模型與人實際發(fā)生的腦缺血更吻合，有利于治療試驗和藥物評價試驗的進(jìn)行[16]。而它的缺點(diǎn)在于長爪沙鼠的前后交通支缺失的類型較多，從理論上來說，只有前后交通支同時缺損才能用單側(cè)結(jié)扎的方法制備模型。

3.2 基因組DNA 文庫的特點(diǎn)

所謂基因組 DNA 文庫是指將某生物體的全部基因組 DNA 用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長度范圍的 DNA 片段，與合適的載體體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽性菌落，具有十分廣泛的用途，如用于分析、分離特定的基因片段，用以基因表達(dá)調(diào)控、人類及動植物基因組工程的研究。

注：1和17：36 kb對照質(zhì)粒，2-16：隨機(jī)挑選的克隆株。

基因組DNA文庫具有代表性和隨機(jī)性雙重特點(diǎn)。其代表性是指文庫中所有克隆所攜帶的 DNA 片段重新組合起來可以覆蓋整個基因組，即可以從該文庫中分離任何一段 DNA。代表性是衡量文庫質(zhì)量的一個很重要的指標(biāo)。其隨機(jī)性是指文庫構(gòu)建過程中采用物理或化學(xué)方法隨機(jī)切割基因組DNA，保證克隆的隨機(jī)性，使每段DNA在文庫中出現(xiàn)的頻率均等。

參考文獻(xiàn)：

[1] Juliana B Casals, Naira CG Pieri, Matheus LT Feitosa,etal. The Use of Animal Models for Stroke Research: A Review[J]. Comp Med. 2011, 61(4): 305-313.

[2] Bing Chun Yan, Joon Ha Park, Bich Na Shin,etal. Neuroprotective Effect of a New Synthetic Aspirin-decursinol Adduct in Experimental Animal Models of Ischemic Stroke[J]. PLoS One. 2013; 8(9): e74886. Published online 2013 September 20. doi: 10.1371/journal.pone.0074886

[3] Ok Kyu Park, Choong Hyun Lee, In Koo Hwang,etal. Effects of repeated restraint stress on platelet endothelial cell adhesion molecule-1 immunoreactivity and protein levels in the gerbil hippocampus after transient cerebral ischemia[J]. Anat Cell Biol. 2010 March; 43(1): 54-63.

[4] 王鉅，盧靜，陳振文，等。長爪沙鼠血液生理生化正常參考值的研究[J]. 中國實驗動物學(xué)報，2004,12(2)：108-111.

[5] Wei Y, Hong Q, Chen D,etal. Permissibility of Mongolian gerbil for Angiostrongylus cantonensis infection and utility of this animal model for anthelmintic studies [J]. Parasitol Res, 2014, 2 , Epub ahead of print.

[6] Shcherbak NS, Galagudza MM, Yukina GY,etal. Morpho-functional changes of the pyramidal neurons in various hippocampal areas after the ischemic postconditioning[J]. Morfologiia, 2013, 143(3):7-13.

[7] Michal Malek, Malgorzata Duszczyk,etal. Hyperbaric oxygen and hyperbaric air treatment result in comparable neuronal death reduction and improved behavioral outcome after transient forebrain ischemia in the gerbil[J]. Exp Brain Res, 2013, 224(1):1-14.

[8] Sne?ana Rau? Balind, Vesna Selakovi, Lidija Radenovi,etal. Extremely Low Frequency Magnetic Field (50 Hz, 0.5 mT) Reduces Oxidative Stress in the Brain of Gerbils Submitted to Global Cerebral Ischemia[J]. PLoS One. 2014; 9(2): e88921. Published online 2014 February 19.

[9] V. Molina, Y. Ravelo, M. Noa,etal. Therapeutic Effects of Policosanol and Atorvastatin against Global Brain Ischaemia-Reperfusion Injury in Gerbils[J]. ndian J Pharm Sci, 2013, 75(6): 635-641.

[10] Heidi L. Lujan, Gurunanthan Palani, Jean D,etal. Targeted ablation of mesenteric projecting sympathetic neurons reduces the hemodynamic response to pain in conscious, spinal cord-transected rats[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2010 May; 298(5): 1358-1365.

[11] D E Levy, J B Brierley, F Plum. Ischaemic brain damage in the gerbil in the absence of 'no-reflow' [J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 1975, 38(12): 1197-1205.

[12] J. 薩姆布魯克，D W 拉塞爾. 分子克隆實驗指南[M]科學(xué)出版社，2002: 15-17.

[13] M J Harrison, J Arnold, L Sedal,etal. Ischaemic swelling of cerebral hemisphere in the gerbil.[J] J Neurol Neurosurg Psychiatry. 1975 ,38(12): 1194-1196.

[14] M Fujishima, J Ogata, T SUGI,etal. Mortality and cerebral metabolism after bilateral carotid artery ligation in normotensive and spontaneously hypertensive rats[J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 1976 , 39(3): 212-217.

[15] Aysan Durukan, Turgut Tatlisumak. Preconditioning-induced ischemic tolerance: a window into endogenous gearing for cerebroprotection[J]. Exp Transl Stroke Med. 2010; 2: 2. Published online 2010 January 21.

[16] Iliana Sosa Teste, Yuneidys Mengana Tamos, Yamila Rodríguez Cruz,etal. Dose Effect Evaluation and Therapeutic Window of the Neuro-EPO Nasal Application for the Treatment of the Focal Ischemia Model in the Mongolian Gerbil[J]. Scientific World Journal. 2012; 2012: 607498. Published online 2012 May 22. doi: 10.1100/2012/607498.