李潤(rùn)花，李雅清，殷國(guó)榮

肌動(dòng)蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor，ADF)/絲切蛋白(cofilin)家族是一類肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，廣泛存在于真核細(xì)胞中。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，其中ADF/cofilin(AC)被認(rèn)為有著重要作用。1980年，Bamburg等首次從雞胚的腦組織中發(fā)現(xiàn)并提純出AC蛋白[1]。AC蛋白是調(diào)節(jié)微絲翻轉(zhuǎn)必不可少的纖維狀肌動(dòng)蛋白(Fibros-actin，F(xiàn)-actin)與球形肌動(dòng)蛋白(Globular-actin，G-actin)結(jié)合蛋白。Cofilin主要通過(guò)切斷肌動(dòng)蛋白絲(actin filaments，AF)來(lái)增加肌動(dòng)蛋白解聚作用，而ADF則通過(guò)螯合ATP-肌動(dòng)蛋白單體從而促進(jìn)F-actin向G-actin的轉(zhuǎn)換來(lái)維持動(dòng)力。兩者在重塑肌動(dòng)蛋白骨架中起重要作用，其中一種蛋白的缺失可由另一種蛋白來(lái)彌補(bǔ)[2]。寄生性原生侵入宿主細(xì)胞與肌動(dòng)蛋白骨架重塑密切相關(guān)[3]。瘧原蟲(chóng)生活周期的轉(zhuǎn)化、克氏錐蟲(chóng)侵入宿主、侵襲性阿米巴的脫囊、剛地弓形蟲(chóng)速殖子滑動(dòng)以及利什曼原蟲(chóng)的發(fā)育在一定程度上均與AC蛋白的含量成正相關(guān)[4-6]。

剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)屬于頂端復(fù)合門(mén)，是一種專性胞內(nèi)寄生蟲(chóng)，可感染侵入大多數(shù)溫血?jiǎng)游锼拗鞯挠泻思?xì)胞。頂端復(fù)合門(mén)寄生原蟲(chóng)是以依賴于肌動(dòng)蛋白絲的滑行運(yùn)動(dòng)(gliding motility)為基礎(chǔ)穿越生物屏障侵入宿主細(xì)胞，而滑行運(yùn)動(dòng)是剛地弓形蟲(chóng)侵入細(xì)胞的獨(dú)特運(yùn)動(dòng)形式[3]。寄生蟲(chóng)在滑動(dòng)時(shí)肌動(dòng)蛋白絲快速組裝和翻轉(zhuǎn)，以提供其侵入的動(dòng)力。然而到目前為止，寄生蟲(chóng)滑行所依賴的微絲翻轉(zhuǎn)特性尚未得到充分的解釋。有研究表明，弓形蟲(chóng)侵入宿主細(xì)胞時(shí)，98%的肌動(dòng)蛋白為球形肌動(dòng)蛋白(G-actin)，即肌動(dòng)蛋白單體維持其運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。弓形蟲(chóng)肌動(dòng)蛋白解聚因子(TgADF)通過(guò)調(diào)節(jié)弓形蟲(chóng)肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)，從而在其侵入宿主中發(fā)揮重要作用，可抑制TgADF可阻止弓形蟲(chóng)持久的滑行運(yùn)動(dòng)，降低其侵入宿主的移動(dòng)速度。近年來(lái)，通過(guò)基因重組構(gòu)建TgADF重組體成為弓形蟲(chóng)疫苗候選抗原的研究方向[7]。

1 AC蛋白家族的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

AC蛋白家族主要包括ADF、cofilin1和cofilin2，雖然他們的氨基酸數(shù)量及序列不盡相同，但其蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)相似性很大[1]。這是由于ADF/cofilin基因的外顯子與內(nèi)含子交界區(qū)序列在不同物種間高度保守，通過(guò)選擇性剪接對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，最終產(chǎn)生相同的多肽[8]。AC蛋白家族的大小從113個(gè)氨基酸到168個(gè)氨基酸不等。ADF具有一個(gè)相當(dāng)保守的長(zhǎng)α-螺旋，可與肌動(dòng)蛋白結(jié)合并促使其解聚，稱為ADF同源區(qū)(ADF-H)。ADF-H也存在于在其他的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白中，如肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白1(actin binding protein 1，ABP1)、肌連腦蛋白、雙絲蛋白等。此外，ADF具有一段Trp100/Met115序列，可結(jié)合磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)，在ADF與肌動(dòng)蛋白的相互作用過(guò)程中十分重要。然而有研究證實(shí)，剛地弓形蟲(chóng)ADF(TgADF)不與PIP2結(jié)合，因而PIP2并不能影響TgADF與G-actin的相互作用[9]。真核生物AC蛋白家族是一類低分子量肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白。單細(xì)胞真核生物僅含有一個(gè)或兩個(gè)AC蛋白，而多細(xì)胞有機(jī)體，如小鼠含有多個(gè)AC蛋白[10]。TgADF含有118個(gè)氨基酸，與其他低分子量肌動(dòng)蛋白單體分離蛋白具有高度同源性，如阿米巴屬的載肌動(dòng)蛋白、植物ADF、酵母及脊椎動(dòng)物絲切蛋白。

通過(guò)Southern blot檢測(cè)表明，TgADF由一段單拷貝基因編碼，屬于功能亞型的AC蛋白。通過(guò)免疫熒光及免疫電鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)TgADF主要定位于速殖子質(zhì)膜下，散落存在于胞漿內(nèi)[11]。與其他生物的ADF相比，TgADF氨基酸序列最短，由于缺乏與F-actin結(jié)合相關(guān)的C端螺旋，而具有低F-actin切斷、高G-actin螯合活性。TgADF含有一段保守的AC蛋白折疊區(qū)，此區(qū)域由中央的6個(gè)β-折疊，周圍包繞3個(gè)α-螺旋和一個(gè)C端卷曲組成。在結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)上，G-actin和TgADF表面結(jié)合的G-actin之間的相互作用，在很大程度上決定了TgADF的高G-actin螯合活性。TgADF的G-actin結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)象的靈活性直接決定了TgADF與G-actin的親和力。有研究發(fā)現(xiàn)，TgADF和兔肌肉G-actin之間相互作用的平衡解離常數(shù)只有23.81nM，顯示出TgADF與G-actin的高親和力[9]。

2 AC蛋白活性的調(diào)節(jié)

肌動(dòng)蛋白絲的解聚和聚合動(dòng)力學(xué)及其骨架重塑成為細(xì)胞遷移、粘附、分化等必不可少的因素。AC蛋白可促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲解聚分離，在肌動(dòng)蛋白絲快速翻轉(zhuǎn)和依賴肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架重塑過(guò)程中扮演重要角色[12]。AC蛋白活性受細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)分子及其自身磷酸化與去磷酸化調(diào)節(jié)。AC蛋白磷酸化酶在肌動(dòng)蛋白絲動(dòng)力學(xué)中起重要作用，其靶位一般是N末端的Ser-3殘基[13]。Ser-3殘基磷酸化可抑制AC蛋白活性而脫磷酸化可恢復(fù)其活性。細(xì)胞中存在一系列分子調(diào)控AC蛋白磷酸化與去磷酸化，從而調(diào)控肌動(dòng)蛋白骨架重塑。AC蛋白的脫磷酸化依賴于AC蛋白的磷酸酶(SSH)。目前為止，至少有3種蛋白激酶參與調(diào)控AC蛋白的磷酸化過(guò)程。有研究證實(shí)，LIM結(jié)構(gòu)域蛋白激酶1和2(LIMK1和LIMK2)可磷酸化AC蛋白Ser-3位點(diǎn)[14-15]。Rho家族小G蛋白R(shí)ac、Rho、Cdc42均可活化LIM激酶[16-17]，由下游效應(yīng)分子p21激酶和Rho相關(guān)激酶介導(dǎo)，分別磷酸化LIMK1的508位和LIMK2的505位蘇氨酸[18]。而熱休克蛋白90(HSP90)可通過(guò)二聚化和磷酸轉(zhuǎn)移途徑調(diào)控LIMKs水平。同時(shí)泛素連接酶Rnf6可降解LIMKs。睪丸特異性激酶1(TESK1)是一種絲蘇氨酸激酶，N末端含一個(gè)蛋白激酶區(qū)，C末端是一個(gè)富含脯氨酸域[19]。TESK1和LMK類似，可磷酸化AC蛋白Ser-3位點(diǎn)，誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白張力纖維形成[20]。不同的是，TESK1的活性由整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)控，并不是p21激酶和Rho相關(guān)激酶[20]。

依賴LIMKs、TESKs調(diào)節(jié)AC蛋白活性在弓形蟲(chóng)尚未見(jiàn)報(bào)道。而剛地弓形蟲(chóng)脫氧核糖磷酸醛縮樣酶(TgDPA)被發(fā)現(xiàn)可提高TgADF蛋白活性。通過(guò)免疫共沉淀和GST-速冷點(diǎn)法測(cè)定TgDPA和TgADF的相互作用，發(fā)現(xiàn)加入GST-TgDPA可降低肌動(dòng)蛋白聚合度、加速肌動(dòng)蛋白絲解聚。AC蛋白對(duì)于肌動(dòng)蛋白的聚合及解聚活性也依賴于pH調(diào)節(jié)[21]，這一點(diǎn)在剛地弓形蟲(chóng)和人均有報(bào)道[11,21]。ADF對(duì)pH的依賴性要高于絲切蛋白，一般而言，在低pH環(huán)境下可以增強(qiáng)AC蛋白穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白的能力，pH<7.1時(shí)可抑制AC蛋白對(duì)肌動(dòng)蛋白的解聚作用，pH升高時(shí)可快速解聚肌動(dòng)蛋白、增強(qiáng)其與肌動(dòng)蛋白單體結(jié)合的能力。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞胞漿內(nèi)pH從7.4降到6.6時(shí)，ADF含量從42%降至23%[22]。然而不同生物體AC蛋白的pH依賴性并不一致，如阿米巴屬的載肌動(dòng)蛋白和酵母絲切蛋白均不受pH影響。此外，還原劑谷胱甘肽可使cofilin二聚化而失去解聚活性[23]，如T細(xì)胞cofilin，因其半胱氨酸位點(diǎn)被谷胱甘肽氧化形成分子內(nèi)二硫鍵而失去解聚活性，從而增加了肌動(dòng)蛋白絲的水平[24]。

3 AC蛋白參與調(diào)控肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)機(jī)制

AC蛋白可增強(qiáng)肌動(dòng)蛋白絲翻轉(zhuǎn)因而被稱為肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)蛋白。AC蛋白對(duì)肌動(dòng)蛋白的動(dòng)力學(xué)影響及調(diào)控機(jī)制復(fù)雜多樣，不僅與肌動(dòng)蛋白絲而且與球狀肌動(dòng)蛋白結(jié)合，既可促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合也可促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲解聚[25-26]。Roland等[27]建立的肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)模型表明，AC蛋白通過(guò)兩方面發(fā)揮解聚活性，一是切斷肌動(dòng)蛋白絲，二是增強(qiáng)肌動(dòng)蛋白單體離開(kāi)肌動(dòng)蛋白絲末的速率。AC蛋白與沿著長(zhǎng)螺距螺旋的肌動(dòng)蛋白亞單位相互作用，解聚肌動(dòng)蛋白絲還是聚合肌動(dòng)蛋白取決于AC蛋白與肌動(dòng)蛋白的摩爾比。當(dāng)肌動(dòng)蛋白絲中AC蛋白與肌動(dòng)蛋白比<1∶100時(shí)，肌動(dòng)蛋白絲持續(xù)切割而解聚；比例上升至1∶10到1∶2時(shí)，肌動(dòng)蛋白絲短暫切割而使其穩(wěn)定在一種扭曲狀態(tài)；比例繼續(xù)上升，當(dāng)AC蛋白過(guò)量時(shí)，肌動(dòng)蛋白不再被切割而維持聚合狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)絲切蛋白濃度很高時(shí)，可促進(jìn)肌動(dòng)蛋白單體聚合、核酸合成以及肌動(dòng)蛋白組裝[28]。

與其他真核生物不同，頂端復(fù)合門(mén)寄生蟲(chóng)的AC蛋白家族成員缺乏F-actin結(jié)合位點(diǎn)，但其仍舊可以促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲分解[3]。重建C端F-actin結(jié)合位點(diǎn)反而降低網(wǎng)狀微絲的解聚活性。通過(guò)免疫熒光和電子顯微鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，抑制TgADF可導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白絲累積，從而降低弓形蟲(chóng)移動(dòng)速度、增加異常移動(dòng)形式、抑制持久的滑行運(yùn)動(dòng)。TgADF是一種弱切割蛋白，需要更高的濃度才可以達(dá)到諸如其他AC蛋白解聚肌動(dòng)蛋白的效應(yīng)。但同時(shí)，由于TgADF的強(qiáng)肌動(dòng)蛋白單體螯合活性，在極低濃度時(shí)即可抑制弓形蟲(chóng)肌動(dòng)蛋白的聚合。TgADF與G-actin結(jié)合，降低G-actin的濃度，促使F-actin向G-actin的轉(zhuǎn)變，從而加速肌動(dòng)蛋白絲解聚翻轉(zhuǎn)。在高濃度G-actin環(huán)境下，TgADF的作用尤為明顯。

4 AC蛋白作為弓形蟲(chóng)疫苗候選抗原的可能性

AC蛋白家族通過(guò)調(diào)節(jié)微絲翻轉(zhuǎn)重塑細(xì)胞骨架，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和分化。家族成員ADF在寄生蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)、粘附及入侵宿主過(guò)程中起重要作用，因此其成為許多寄生蟲(chóng)疾病候選疫苗研究的熱點(diǎn)[29]。早在1997年Allen等[11]就已經(jīng)克隆表達(dá)出剛地弓形蟲(chóng)ADF，研究了TgADF與調(diào)控肌動(dòng)蛋白解聚的關(guān)系，并提出抑制TgADF阻遏弓形蟲(chóng)入侵宿主的可能。隨后，通過(guò)重組剛地弓形蟲(chóng)ADF免疫小鼠觀察其免疫保護(hù)性的研究越來(lái)越多。2009年黃祥盛[30]構(gòu)建pET28a(+)-TgADF重組質(zhì)粒和重組ADF蛋白分別免疫小鼠，通過(guò)檢測(cè)T細(xì)胞數(shù)量和腦內(nèi)蟲(chóng)荷研究弓形蟲(chóng)ADF的免疫保護(hù)性。2011年Li等[7]用pVAX1-TgADF重組質(zhì)粒免疫小鼠，腦內(nèi)減蟲(chóng)率達(dá)42.8%。TgADF作為弓形蟲(chóng)疫苗候選抗原成為了可能，在抗弓形蟲(chóng)感染中具有一定的作用。

綜上所述，隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)及體外分析等各種技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，對(duì)AC蛋白家族的結(jié)構(gòu)、氨基酸序列、功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等各個(gè)方面的研究越來(lái)越深入。對(duì)于剛地弓形蟲(chóng)而言，ADF是其侵入宿主細(xì)胞過(guò)程必不可少的因素。研究AC蛋白家族作為疫苗候選抗原具有潛在的價(jià)值。

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