譚 偉,李 孟，謝芝勛

流感大流行嚴(yán)重地危害人們的身體健康、影響人們的日常工作和生活。1918年發(fā)生的“西班牙流感”(H1N1亞型)曾造成全球大約四千多萬人的死亡,疫情波及到世界上許多國家[1]。此后,還陸續(xù)發(fā)生過1957年的“亞洲流感”(H2N2亞型)、1968年的“香港流感”(H3N2亞型)及2009年的“墨西哥流感”(H1N1亞型)[1]。

2003-2004年,在香港、荷蘭、泰國及越南等國家又分別發(fā)現(xiàn)了HPAIV感染人的病例[4]。2013年3月底在我國上海和安徽等一些省份也陸續(xù)發(fā)生了AIV(H7N9亞型)感染人并引發(fā)死亡的病例[5]。雖然目前人們普遍認(rèn)為AIV通過人傳播給人的概率很低,但AIV極易發(fā)生變異及近些年來有關(guān)AIV感染人的報道呈逐漸增多的趨勢,迫切需要政府和防疫部門去更多地關(guān)注禽流感的監(jiān)測、診斷及預(yù)防等問題。因此研發(fā)快速、特異、靈敏、簡便的AIV監(jiān)測及診斷試劑目前已成為AIV研究的熱點問題。

短暫等待和延遲滿足不一樣，它給了孩子一個確定的指向，并且時間相對較短。很多時候，我們?nèi)菀椎凸篮⒆拥牡却芰Γ驗樗麄兛偸潜憩F(xiàn)出馬上就要反饋的樣子，讓我們覺得孩子都是急性子。其實，兒童心理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，一歲到三歲的孩子，慢慢就具備了短暫等待的能力，比如他們能等到別的小朋友玩過后，再玩同一個玩具。

1 禽流感病毒的特點

AIV的天然宿主包括水禽、野生鳥類和候鳥等[6]。AIV能夠通過消化道或呼吸道感染水禽。AIV若傳染給人則會造成嚴(yán)重的危害,重者可導(dǎo)致患者呼吸系統(tǒng)功能衰竭、甚至死亡。AIV屬于正粘病毒科(Orthomyxovirdae)甲型流感病毒屬,是有囊膜的、單股、分節(jié)段、負(fù)鏈RNA病毒[1]。AIV含有8個基因片段, 可以編碼10個不同的病毒蛋白,包括血凝素(Hemagglutinin,HA)、神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)、基質(zhì)蛋白(M1、M2)、核蛋白(NP)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2)以及RNA聚合酶P蛋白復(fù)合體(PB1、PB2、PA)[1]。HA蛋白含有中和抗原決定簇,可以刺激機體產(chǎn)生保護(hù)性抗體,而NA蛋白刺激產(chǎn)生中和抗體的能力則稍弱。

A型流感病毒的宿主范圍廣,既可以感染人,也能夠感染其它種屬的宿主,如雞、鴨、鵝、野生鳥類、豬、馬、狗、貓、虎、水貂等[7]。季節(jié)性流感大多是由A型流感病毒所引起。值得指出的是,目前已知的流感大流行均是由A型流感病毒所造成的。雖然過去關(guān)于AIV直接感染人的報道不多,但近些年來有不少這方面的報道[3,5]。根據(jù)AIV兩個表面蛋白(HA和NA)抗原性的不同，可將AIV分成16個HA亞型(H1-H16)及9個NA亞型(N1-N9)[6]。還可根據(jù)病毒基因組序列及地理分布的差異,將AIV分為北美譜系(North American lineage)和歐亞譜系(Eurasian lineage)[8]。

克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇快速檢測卡由北京維德康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，國家獸藥安全評價中心監(jiān)制，貴州省獸藥飼料監(jiān)察所提供?？焖贆z測卡需保存在（20±5） ℃的環(huán)境中，有效期為12個月，具體生產(chǎn)日期見批號。該種檢測卡主要檢測豬、牛、羊等動物，可以檢測其尿液和屠宰后的酮體。

2 禽流感病毒的傳統(tǒng)檢測方法

AIV的特異性核酸序列經(jīng)過常規(guī)RT-PCR反應(yīng)擴增后,通過電泳后觀察特異性PCR產(chǎn)物片段的大小來判斷是否在檢測樣本中含有AIV的特定基因片段。由于常規(guī)RT-PCR方法的特異性及敏感性較高,且不需要復(fù)雜昂貴的實驗設(shè)備,因此這一方法被廣泛用于AIV的檢測及診斷。

病毒分離的具體做法是: 采用9～11 d齡無特異性病原體的雞胚，在其尿囊腔內(nèi)接種懷疑有AIV的樣本,將接種后的雞胚在35～37 ℃的條件下孵育3～7 d[9]。收集接種24 h后死亡的雞胚及第7 d未死雞胚中的尿囊液測定其血凝活性。若血凝試驗測定結(jié)果為陽性,則說明尿囊液中很可能含有AIV。如果第一代分離物血凝試驗結(jié)果呈陰性,尿囊液樣本再用雞胚傳1～2代,采用相同方法觀察雞胚的發(fā)育情況和檢測尿囊液中的血凝活性。因為有些檢測樣本中的病毒含量很低，需要通過雞胚連續(xù)培養(yǎng)來獲得高滴度的病毒。

（2）夏季強輻射和高溫使得大氣的氧化性提高。夏季O3能夠顯著地影響大氣氧化性，強的大氣氧化性促進(jìn)二次顆粒物形成。在冬季，O3對于大氣氧化性的貢獻(xiàn)不顯著，NO2對于大氣氧化性的增強有更多的貢獻(xiàn)。

母液循環(huán)套用時，作為起催化作用的甲醇鈉不加或者減少加入量是否對產(chǎn)品的收率有一定的影響？在保持其他反應(yīng)條件不變的前提下，逐步增加甲醇鈉的量，觀察收率與含量的變化，如表4所示。

歷經(jīng)風(fēng)雨之后，方知社會是復(fù)雜的，水仙芝不想把它看得更復(fù)雜。她想過一種簡單的生活，一種純凈、沒有污染的生活。讀了很多書，她更不相信書，倒相信感覺。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi等人于2000年最先報導(dǎo)的[22]。該反應(yīng)體系在等溫條件下擴增DNA，不用對核酸進(jìn)行變性和復(fù)性，但需要設(shè)計4個引物來識別靶DNA序列上的6個不同結(jié)合位點。此法能在很短時間內(nèi)復(fù)制模板獲得109的擴增產(chǎn)物。后來人們又建立了使用6個簡并引物的逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(RT-LAMP)[23]。

2.3AIV的毒力測定 AIV的毒力主要是通過6 w齡雞體實驗的靜脈內(nèi)致病指數(shù)(Intravenous pathogenicity index,IVPI)來判定,即若AIV在6 w齡雞體內(nèi)的IVPI大于1.2時,則認(rèn)為被檢毒株屬于HPAIV[9]。另一常用的判定毒力方法是,當(dāng)AIV經(jīng)靜脈途徑感染4～8 w齡雞后,若在10 d內(nèi)引起至少75%的雞群死亡,則也可以將所測定的AIV毒株劃歸為HPAIV[9]。研究結(jié)果表明,目前所發(fā)現(xiàn)的HPAIV大多是H5或H7亞型。盡管仍有不少H5或H7亞型的AIV是LPAIV,可是一旦它們經(jīng)基因突變或基因重配后就很有可能形成HPAIV，感染新的宿主。

NASBA法的優(yōu)點在于它在細(xì)胞基因組DNA存在的情況下仍能特異性地擴增病毒單鏈RNA序列。實時熒光NASBA也已被用于檢測不同亞型的AIV[10]。由于此法特異、簡便易行,不需要PCR反應(yīng)儀及熒光檢測器等設(shè)備,因此該方法已成為發(fā)展中國家禽流感疫情監(jiān)測和診斷的重要手段之一。

3 分子生物學(xué)手段檢測禽流感病毒

應(yīng)用分子生物學(xué)手段檢測禽流感病毒是近十多年來的發(fā)展趨勢[9-10,15,17],其優(yōu)點是快速、敏感、特異、可靠且便于操作。一旦發(fā)現(xiàn)疑似禽流感流行,首先采取的措施是“撲殺政策”以清除傳染源。因此建立快速、特異、敏感、便捷的檢測AIV的分子生物學(xué)手段對監(jiān)測、控制及預(yù)防禽流感意義重大。

貨幣資金是重要的企業(yè)資產(chǎn)，在正常生產(chǎn)經(jīng)營過程中起關(guān)鍵性的作用，是企業(yè)關(guān)注的重點資產(chǎn)之一，而正由于貨幣資金的重要性和流動性，貨幣資金舞弊現(xiàn)象也常有發(fā)生。加強貨幣資金的內(nèi)部控制，對于保證資金安全,提高資金運營效率,促進(jìn)企業(yè)持續(xù)健康發(fā)展起著非常重要的作用。

3.1逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)可分為一步法和兩步法[18]。一步法的優(yōu)點是快速、簡便。病毒RNA分子的轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)均在同一個管內(nèi)進(jìn)行,從而減少了交叉污染的機會。兩步法是先進(jìn)行病毒RNA的轉(zhuǎn)錄,然后再啟動PCR反應(yīng)。由于病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)條件分別進(jìn)行優(yōu)化,所以兩步RT-PCR法要比一步法檢測靈敏度更高。同時兩步法中得到的病毒互補DNA產(chǎn)物的量足以用于多次檢測，便于優(yōu)化最佳的PCR反應(yīng)條件及重復(fù)實驗。而一步法則在每次實驗中都會直接消耗病毒RNA模板。因此當(dāng)臨床上得到的病毒RNA樣本量很少的情況下，采用兩步法似乎更為可取。

2.1病毒分離及血清學(xué)檢測方法 AIV的鑒別診斷相對比較復(fù)雜,一方面是由于AIV的抗原性容易發(fā)生改變,另一方面則是因為AIV在其天然宿主中一般不引起嚴(yán)重的病癥,即使出現(xiàn)一些臨床癥狀也不典型、不明顯。檢測AIV的常用方法有病毒分離鑒定和血清中AIV特異性抗體的檢測。病毒分離方法特異、敏感、可靠，是檢測AIV的“金標(biāo)準(zhǔn)”(Gold Standard)[9]。這一方法能對病毒的生物學(xué)性狀進(jìn)行分析,同時增殖大量的病毒也為測定病毒全基因組序列或進(jìn)行其它檢測和生物學(xué)特性分析準(zhǔn)備了充足的材料。

3.2實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) Spackman等人于2002年首次報道了采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time RT-PCR,RRT-PCR)來檢測H5及H7亞型的AIV核酸序列[19]。實時熒光定量RT-PCR不僅需要一對PCR引物來特異性地擴增AIV的基因序列,同時還需要一個用熒光標(biāo)記的探針來監(jiān)測PCR產(chǎn)物的擴增狀態(tài)。此法與常規(guī)RT-PCR的最大不同之處在于,它可以監(jiān)測到每一時刻產(chǎn)物的積聚程度。RRT-PCR的特點是快速,特異性及敏感性也很好,不需要傳統(tǒng)的電泳分析步驟,既省時又能對擴增產(chǎn)物做定量分析。但需注意的是應(yīng)同時測定反應(yīng)體系中內(nèi)參基因的表達(dá)水平以排除假陰性。

影響RRT-PCR敏感性的因素有很多,例如,抽提得到的病毒RNA的量、純度以及RNA是否被降解、RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中引物、PCR反應(yīng)條件、PCR反應(yīng)體系中是否存在DNA聚合酶的抑制劑、以及PCR引物和探針的設(shè)計等。目前用RRT-PCR來檢測AIV已成為世界上許多國家和地區(qū)的AIV參考實驗室所常規(guī)使用的診斷方法之一[15]。多重RRT-PCR可以用于快速檢測和區(qū)分不同亞型的AIV[20]，適合臨床樣本的檢測。

3.3核酸序列依賴性擴增法 核酸序列依賴性擴增法(Nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)最早是由Kwoh等人報道[21],此法是根據(jù)轉(zhuǎn)錄及逆轉(zhuǎn)錄原理來等溫擴增病毒核酸序列[21]。擴增反應(yīng)需要上游及下游引物,其上游引物的5′末端含有啟動子序列，可以被噬菌體T7依賴于DNA的RNA聚合酶所識別。而下游引物的5′末端則含有一段特殊設(shè)計的序列,它能與經(jīng)電化學(xué)發(fā)光物標(biāo)記的檢測探針互補結(jié)合。

學(xué)生干部群體作為優(yōu)秀學(xué)生的集合體，有更多與外校優(yōu)秀學(xué)生交流的機會，并且容易從各種途徑獲得參加國際競賽的信息，他們之間相互鼓勵，形成良性循環(huán)，因此，學(xué)生干部對專業(yè)英語的重要性認(rèn)知高于非學(xué)生干部學(xué)生。教師可以利用課堂時間，給予學(xué)生相互交流的機會，不定期開展跨班、跨年級，甚至跨專業(yè)、跨院系的小講座，豐富課余生活的同時也能開闊學(xué)生眼界，認(rèn)清自身不足，激發(fā)學(xué)習(xí)動力。

判斷H5或H7亞型的LPAIV有無可能成為HPAIV的一個常用標(biāo)準(zhǔn)是:通過序列測定檢查病毒HA前體中的蛋白酶裂解位點附近是否含有多個堿性氨基酸。人們發(fā)現(xiàn)在HA前體蛋白裂解位點附近,LPAIV大多含有一個精氨酸,而HPAIV則常含有多個堿性氨基酸,除了含精氨酸外還含有賴氨酸[9]。然而值得注意的是例外的情況也時有發(fā)生。

3.4環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法

值得注意的是,AIV經(jīng)過適應(yīng)后也可以感染其它畜類(像豬、馬等)。因此這些被感染的動物亦可以作為AIV的短期中間宿主。根據(jù)對雞或火雞致病性的不同，可將AIV分為高致病性(Highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(Low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)[9]。HPAIV可感染不同組織中的多種細(xì)胞引起全身性感染,而LPAIV引起的感染則常局限于呼吸道或消化道。

2.2病毒特異性抗原的檢測法 病毒特異性抗原檢測法采用的原理主要利用針對AIV特異性抗原的抗體來捕獲AIV特異性抗原，例如瓊脂擴散試驗及酶聯(lián)免疫吸附試驗等[11]。目前已有檢測AIV特異性抗原的試劑盒問世[12]。由于AIV的核蛋白(NP)相對保守,不易變異,所以目前采用的病毒抗原捕獲免疫測定主要是用來檢測AIV的核蛋白。AIV特異性抗原檢測法的優(yōu)點是快速,據(jù)報道有些方法可以在30 min之內(nèi)得到檢測結(jié)果[13]。目前可以檢測AIV N1、N2、N3及N7亞型的抗體的ELISA方法均已建立[14]。但抗原測定法目前存在的主要問題是檢測敏感度低于病毒分離法及病毒核酸檢測法,同時對所測樣品的質(zhì)量要求較高。檢測AIV特異性抗體的試劑盒則可用于評估鳥類或禽類是否曾接觸或感染過AIV。

此法快速、簡便、易于操作、不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備、且反應(yīng)可在水浴中完成，因此這一方法用于發(fā)展中國家AIV的野外篩查、監(jiān)測和診斷有著廣泛的應(yīng)用前景。LAMP及RT-LAMP的檢測靈敏度受其檢測體系中引物的影響。因此應(yīng)收集和分析新出現(xiàn)的AIV變異株的序列結(jié)構(gòu),并以此來不斷優(yōu)化RT-LAMP的引物從而提高RT-LAMP法檢測AIV流行變異株的敏感性。

3.5基因芯片法 基因芯片法(DNA Microarray)是在20世紀(jì)90年代發(fā)展起來高通量檢測技術(shù)[24]。它可以用來同時檢測細(xì)胞基因組中上萬個基因RNA轉(zhuǎn)錄體表達(dá)的變化。此法采用的基本原理是DNA與其互補序列彼此雜交?；蛐酒ò?個基本操作步驟：基因芯片的制作、樣本制備、雜交、檢測、數(shù)據(jù)的采集和分析。簡單來說，就是在固狀載體表面結(jié)合上預(yù)先選擇設(shè)計好的檢測捕獲探針，然后將待測及對照樣本用不同的熒光物進(jìn)行標(biāo)記。等比例混合熒光標(biāo)記產(chǎn)物后再加入基因芯片中使之與不同的檢測探針雜交。雜交信號通過熒光激光掃描檢測器收集后，再用計算機分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理[24]。

基因芯片法可以比較多種基因的表達(dá)圖譜，用于檢測AIV樣品中的基因型、基因的缺失、擴增以及基因測序等。FluChip及M基因芯片法已被用來特異性地檢測A型流感病毒的不同亞型[25]。據(jù)報道采用M基因芯片法，從病人臨床樣本中提取病毒RNA到完成基因芯片檢測只需要不到7個小時的時間[25]?；蛐酒ㄒ部捎糜跍y定HPAIV或LPAIV感染細(xì)胞后宿主基因表達(dá)的變化，從而了解AIV的強、弱毒株通過哪些細(xì)胞內(nèi)通路來影響細(xì)胞基因的表達(dá)?；蛐酒ㄒ嗫梢杂脕頇z測AIV基因組的堿基突變。

3.6常規(guī)測序及新一代DNA測序方法 DNA測序法最早是分別由Maxam和Gilbert(化學(xué)法)以及Sanger(酶法)等人所建立[26-27]。以后Sanger測序法逐漸被世界上許多實驗室所廣泛采用。傳統(tǒng)的、手工操作的Sanger測序法現(xiàn)已發(fā)展成為半自動的毛細(xì)管電泳法。Sanger法可以直接測定細(xì)胞基因組DNA或?qū)⒏信d趣的DNA片段擴增放大后再測序。一般來講，Sanger測序法的一個反應(yīng)可以準(zhǔn)確測定約800 bp左右的DNA序列[28-29]。至今Sanger法在AIV亞型及全基因組序列的測定中仍發(fā)揮著重要作用。

經(jīng)雞胚培養(yǎng)分離出具有血凝活性的AIV后,可以通過血凝抑制試驗(HI)、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(NI)來鑒定AIV的亞型。病毒分離法和血清學(xué)方法的優(yōu)點在于它們可以用來準(zhǔn)確判斷是否發(fā)生了AIV的感染。然而它們卻難以監(jiān)測環(huán)境中由于突變不斷產(chǎn)生的新的AIV變異株[10]，這主要是由于人們常常缺乏針對新出現(xiàn)的AIV抗原變異株起特異性反應(yīng)的血清、抗體及相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)診斷試劑。

近年來發(fā)展起來的新一代測序方法包括Roche的454基因組測序儀(454 Genome Sequencer)，Illumina的基因組分析儀(the Genome Analyzer)以及Applied Biosystems的SOliD系統(tǒng)等[28-29]。這些測序技術(shù)的最大特點是高通量檢測，一次反應(yīng)測定出的堿基序列可達(dá)gigabase(109)[30]。與常規(guī)測序法不同，新一代測序法測定的DNA長度較短，從25～400 bp不等。但新一代測序技術(shù)不是簡單地測定單一的DNA分子序列，而是同時對高達(dá)10萬(Roche 454系統(tǒng))甚至數(shù)百萬(the Genome Analyzer和SOLiD系統(tǒng))的DNA分子進(jìn)行反復(fù)多次的測定，因此這種測序方法的精確度很高。

新一代測序法主要用來發(fā)現(xiàn)DNA中新突變的堿基，而常規(guī)測序法則可用來進(jìn)一步驗證新一代測序法得到的結(jié)果。AIV是RNA病毒，只要將其RNA基因經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)變成互補DNA就可以對其基因進(jìn)行測序。新一代測序法不僅可用于檢測多種AIV毒株的亞型，同時還可以測定病毒基因組的全序列[24,28]。基因芯片法和新一代測序法的特點是高通量、快速，自動化程度高，并能精確檢測到單個核苷酸的水平。但是基因芯片法在設(shè)計檢測探針的時候必須事先知道所要測定的細(xì)胞或病毒基因組的核苷酸序列，而新一代測序法則沒有這個限制。因此在監(jiān)測新出現(xiàn)的AIV變異株這方面，新一代測序法可能要比基因芯片法有更大的優(yōu)勢。盡管以上兩種方法優(yōu)點明顯，但由于需要昂貴的儀器設(shè)備及分析軟件，所以它們目前在一般的臨床檢測實驗室里還沒有被廣泛采用。

隨著檢測技術(shù)的更新、發(fā)展及檢測成本的逐步降低，基因芯片法和新一代測序法很可能會在不遠(yuǎn)的將來發(fā)展成為檢測AIV亞型及其全基因組測序的重要手段。

4 結(jié) 語

監(jiān)測AIV的流行變異株有助于流感疫苗株的選用,同時也是監(jiān)測評估AIV在環(huán)境及易感宿主中變化的重要一環(huán)?？焖贆z測及診斷AIV在野鳥、家禽及其它種屬動物中的流行分布及流行株遺傳變異等對控制AIV的傳播意義重大。一方面人們應(yīng)在現(xiàn)有方法的基礎(chǔ)上不斷改善目前已使用的AIV檢測方法,新型檢測方法及試劑盒應(yīng)能準(zhǔn)確地區(qū)分AIV的16個HA亞型及9個NA亞型, 同時還應(yīng)能鑒別區(qū)分HPAIV與LPAIV。

目前所開展的校企合作還不夠深入，不少企業(yè)在校企合作培養(yǎng)人才過程中積極性不高，更愿意提供學(xué)生實踐的場所，不愿意花更多精力參與培養(yǎng)過程。為了提高企業(yè)的參與度，有學(xué)者認(rèn)為“政校企”合作應(yīng)是我國教育發(fā)展的新模式，在地方政府部門的支持和引導(dǎo)下，企業(yè)與高校密切合作，形成地方政府、高校、企業(yè)三方共同參與，建立相互依賴、互利互惠的合作伙伴關(guān)系[5]。根據(jù)德國校企合作經(jīng)驗，開展深度的校企合作，應(yīng)建立、健全、完善校企合作的激勵機制，充分考慮各種因素，全面激發(fā)各參與主體合作的熱情，制定一系列科學(xué)合理的獎勵措施、一攬子行之有效的懲戒舉措，充分挖掘產(chǎn)學(xué)研合作各方的潛力[6]。

應(yīng)探索開發(fā)新型的分子生物學(xué)檢測手段,使其在快速檢測，亞型鑒別，毒力監(jiān)測和變異株篩查等方面取得新進(jìn)展和突破。今后AIV檢測方法的研究應(yīng)朝快速、特異、靈敏、準(zhǔn)確、高通量、價廉、便于攜帶并可用于野外操作的方向來發(fā)展。早期檢測、快速應(yīng)對、及時采取適當(dāng)?shù)姆婪洞胧┦穷A(yù)防,控制流感大流行的關(guān)鍵。堅持長期監(jiān)測、對AIV流行變異株做序列相關(guān)性分析及流行病學(xué)的調(diào)查將會為預(yù)測禽流感的發(fā)生趨勢、掌握其變化規(guī)律提供有力的科學(xué)依據(jù)。

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