朱 彬，張萬江

近年來隨著人口的增長和流動、與HIV的伴發(fā)感染、卡介苗免疫效率的不穩(wěn)定、以及耐藥性菌株的日益增多，全球結(jié)核病疫情再度回升。尤其是耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant TB，MDR-TB)、廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant TB，XDR-TB)，以及全耐藥結(jié)核病(totally drug-resistant TB，TDR-TB)的出現(xiàn)，給結(jié)核病的的防控工作造成了巨大的壓力[1]。結(jié)核病的耐藥機(jī)制除了與藥物因素引起結(jié)核分枝桿菌染色體上某些基因的突變等有關(guān)外，還與非藥物因素有關(guān)，如結(jié)核分枝桿菌的滯留特性、主動外排系統(tǒng)的功能、宿主體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境等；即非藥物因素也是導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌耐藥發(fā)生的重要原因。

蛋白酶體途徑是真核細(xì)胞中除溶酶體外降解蛋白質(zhì)的又一主要途徑。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)都要先被泛素標(biāo)記，進(jìn)一步被多泛素化，而后被19S調(diào)節(jié)顆粒識別，再將其導(dǎo)入蛋白酶體降解[2-3]。2008年，Pearce等在結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)中發(fā)現(xiàn)了與真核細(xì)胞中的泛素功能相似的蛋白質(zhì)，命名為原核類泛素蛋白(prokaryotic ubiquitin-like，Pup)[4]。結(jié)核分枝桿菌Pup與結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體組成了結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)(Pup-poroteasome system，PPS)。在PPS中，Pup可以在輔助因子的作用下標(biāo)記多種功能蛋白，并介導(dǎo)被標(biāo)記蛋白質(zhì)通過蛋白酶體降解。在結(jié)核分枝桿菌中，Pup - 蛋白酶體系統(tǒng)有助于致病細(xì)菌宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)的持久性支持[5]。PPS的發(fā)現(xiàn)揭示了原核生物中一個嶄新的蛋白質(zhì)降解機(jī)制，對PPS降解蛋白質(zhì)途徑的作用機(jī)理和生理功能的研究已成為當(dāng)前病原菌研究的熱點。對PPS的研究有望找到更有效的抗結(jié)核藥物作用的靶點。為此，本文對結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體的研究進(jìn)展做如下綜述。

1 Pup-蛋白酶體系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

1.1Pup的結(jié)構(gòu)特點 結(jié)核分枝桿菌中的Pup是一個由64個氨基酸組成的C-末端區(qū)域呈螺旋狀的內(nèi)部結(jié)構(gòu)混亂的無序蛋白，可以對結(jié)核分枝桿菌待降解的蛋白質(zhì)進(jìn)行識別和修飾，然后將其導(dǎo)入結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體進(jìn)行降解[4]。Pup含有獨特的區(qū)域與Pupulation酶(Pupulation enzymes)相互作用，并引發(fā)底物蛋白的蛋白酶體降解，其螺旋狀C-末端介導(dǎo)其與底物蛋白質(zhì)的連接，而其氨基末端則對于其降解功能的發(fā)揮至關(guān)重要[6]。雖然Pup與真核生物中各種泛素樣蛋白質(zhì)序列相比相似性很低，但它們的三維結(jié)構(gòu)卻高度保守，都呈現(xiàn)典型的類泛素折疊模式。盡管Pup與泛素在序列和對蛋白底物的靶向連接過程等方面存在一些差異，但兩者在介導(dǎo)蛋白底物的蛋白酶體靶向降解方面所發(fā)揮的作用是相似的[7-8]。Pup是一種無序蛋白(inrrinsically disordered protein，IDP)，其結(jié)構(gòu)為不穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)[9]；Pup標(biāo)記蛋白質(zhì)后其N端仍保持無序狀態(tài)，C端S21-K61形成螺旋結(jié)構(gòu)，能與Mpa(mycobacterial proteasome ATPase)的N端螺旋結(jié)構(gòu)域非共價作用，可被Mpa傳遞入蛋白酶體進(jìn)行降解[10-11]；因此Pup可能具有兩種功能，它不僅是讓底物成為蛋白酶體識別的標(biāo)記物，而且使靶蛋白帶上無序標(biāo)簽，有利于靶蛋白的降解[6]。

1.2蛋白酶體的結(jié)構(gòu)特點 結(jié)核分枝桿菌的蛋白酶體為750 kDa，其結(jié)構(gòu)與真核生物的蛋白酶體結(jié)構(gòu)相似，呈桶狀結(jié)構(gòu)，包含由α亞基形成的2個7元外環(huán)和β亞基形成的2個7元內(nèi)環(huán)。蛋白水解發(fā)生在β亞基N-末端的蘇氨酸上。真核生物蛋白酶體含有7種α亞基和7種β亞基，其中只有3種β亞基(β1、β2、β5)具有蛋白水解活性。而原核生物蛋白酶體則通常只含有1種或2種類型的α和β亞基，其中結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體的β亞基為單一的類型，并且14個β亞基中的每一個均提供1個N末端蘇氨酸的活性位點[12]。冷凍電鏡技術(shù)顯示：結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體的核心顆粒具有1個閉合的尾部，這個結(jié)果與負(fù)染色電鏡技術(shù)所顯示的密度測定結(jié)果是一致的。α-亞基N-末端八倍體的存在進(jìn)一步提示結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體含有1個門控式結(jié)構(gòu)[13]。真核生物蛋白酶體的核心顆粒可通過7個α亞基的不同氨基末端肽關(guān)閉其蛋白底物的入口，而結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體的晶體結(jié)構(gòu)則提示其核心顆粒的門控是被7個相同的肽通過3種不同的構(gòu)象緊緊密封的[3]。

2 結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)的降解過程

Mtb中Pup-蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程與真核生物中的泛素化過程類似，Mtb中的Pup通過pupylation反應(yīng)后使底物蛋白被標(biāo)記上Pup并隨之被蛋白酶體降解。pupylation過程類似于泛素化，但其酶學(xué)反應(yīng)過程與泛素化過程不盡相同。近幾年研究證明，利用結(jié)核桿分枝菌pupylation途徑，可以幫助克服其宿主的免疫防御，使結(jié)核分枝桿菌在宿主內(nèi)生存[14]。pupylation過程包括1個獨立的脫酰胺作用和1個接合反應(yīng)，分別通過Pup的去酰胺 (Dop)和Pup連接酶PafA來催化：Pup C端Gln在去酰胺酶Dop催化下形成Glu；在PafA 連接酶的作用下，通過水解ATP，使Pup C端Glu磷酸化，并催化其以共價鍵的形式與底物蛋白上的Lys連接；Pup標(biāo)記的蛋白質(zhì)通過Pup C端與Mpa N端相互作用，Mpa水解ATP 打開蛋白酶體核心區(qū)域的門(α亞基)，傳遞底物蛋白到蛋白酶體的核心區(qū)域，同時Dop促使去Pup化，使Pup重復(fù)利用；底物經(jīng)由蛋白酶體被降解。

3 結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)中輔助因子與致病性的關(guān)系

在真核生物當(dāng)中，泛素所介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解需要泛素活化酶E1，泛素偶聯(lián)酶E2，特異性識別蛋白底物的泛素連接酶E3，ATP酶及許多調(diào)節(jié)亞基等一系列輔助因子來參與調(diào)節(jié)，這些輔助因子參與靶蛋白的泛素化和去泛素化過程，來調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解。原核生物中Pup-蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解也需要輔助因子，目前已知的輔助因子有Mpa(mycobacterial proteasome ATPase)、 Dop (deamidase of Pup) 和PafA (proteasome accessory factor A)。在對NO 敏感的結(jié)核分枝桿菌的研究過程中發(fā)現(xiàn)，多個與蛋白酶體相關(guān)的基因突變后會導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對NO敏感，導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌存活率顯著降低，這說明蛋白酶體的相關(guān)基因在結(jié)核分枝桿菌的致病過程中發(fā)揮著極其重要的作用[13]。

Mpa：1998年，Wolf 等發(fā)現(xiàn)，放線菌中蛋白酶體基因的上游基因Rv2115c 可編碼具有ATP 水解功能的蛋白質(zhì)[15]；與真核生物中蛋白酶體19S 調(diào)節(jié)顆粒中的ATP 酶具有同源性，且兩者的功能相似，即參與調(diào)節(jié)蛋白酶體α亞基“門”的開關(guān)；同時，Mpa 自身是原核蛋白酶體的底物，表明原核蛋白酶體可以通過對Mpa 的降解進(jìn)行自我功能的反饋調(diào)節(jié)，結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體功能與此相似。研究表明，當(dāng)Mpa基因缺失或突變時，蛋白酶體對結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)能力大大降低，而且結(jié)核分枝桿菌菌株的毒力也減弱了[16-17]；導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)和體外的生長速率減慢，結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)的殺傷力減弱[18]。

連接酶PafA：由結(jié)核分枝桿菌 Rv2097c 基因編碼，與γ-谷氨酰半胱氨酸具有同源性，是一個依賴于ATP的羧氨連接酶。研究表明，PafA是蛋白酶體底物保持穩(wěn)定水平的關(guān)鍵[19]；當(dāng)PafA基因突變或者是缺失時，可導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體系統(tǒng)抗活性氮中間體(RNI)的能力減弱；而一氧化氮(NO)和其他活性氮中間體(RNI)的產(chǎn)生，有助于控制感染的結(jié)核分枝桿菌，而結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體的輔助因子可保護(hù)結(jié)核分枝桿菌不受NO和RNI的損傷[20]。 Cerda-Maira和Festa等[19，21]發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌PafA基因的突變可以造成底物蛋白的積累，同時檢測不到Pup標(biāo)記蛋白的存在，說明PafA對于Pup與靶蛋白連接是必需的，對于蛋白酶體降解底物蛋白過程中不可或缺的部分。

去酰胺酶Dop：Dop 蛋白由Rv2112c 基因編碼，其氨基酸序列與真核生物蛋白酶體系統(tǒng)中的E1、E2 和E3 沒有同源性，但與羧氨連接酶具有一定同源性[22]。Pup 蛋白C端序列為Gly-Gly-Gln，Dop的N端可以催化去酰胺化反應(yīng)，將Pup C端的Gln轉(zhuǎn)變?yōu)镚lu。Imkamp等[23]通過敲除恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis，Msm)菌株Dop基因構(gòu)建了Dop缺失突變株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的Pup化在Msm中不能進(jìn)行，致使造成底物蛋白的大量積累。又將Dop基因重新植入Dop缺失突變株中，蛋白質(zhì)的Pup化恢復(fù)正常，此研究表明Dop催化的去酰胺化反應(yīng)對Pup與靶蛋白的共價連接是必需的。2010 年Burns和Imkamp等[24-25]發(fā)現(xiàn)，Dop不但具有蛋白質(zhì)的Pup化功能，還具有去Pup化功能，在Dop的作用下被Pup標(biāo)記的底物蛋白FabD、Ino1和PanB可以被去Pup化，產(chǎn)生游離的Pup，這一去Pup過程依賴于Mpa的存在。

由此證明，結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體的輔助因子和結(jié)核分枝桿菌的致病性及在宿主細(xì)胞的持留有密切關(guān)系。

4 結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)底物蛋白與致病性的關(guān)系

實驗證實，在結(jié)核分枝桿菌中，能被Pup標(biāo)記且被蛋白酶體降解的底物蛋白有FabD、PanB、Ino1、Icl、SodA、MtrA等，這些底物蛋白各自具有重要的生物學(xué)功能，同時與結(jié)核分枝桿菌的致病性和在宿主細(xì)胞的持留具有密切關(guān)系[8，26]。如丙二酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)酰酶FabD在結(jié)核分枝桿菌內(nèi)是催化脂肪酸合成的重要酶，而結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁含有大量脂肪酸，增加其對外界復(fù)雜環(huán)境的抵抗力，它和結(jié)核分枝桿菌逃逸免疫系統(tǒng)攻擊的能力、結(jié)核分枝桿菌的毒力息息相關(guān)；與結(jié)核分枝桿菌的發(fā)病機(jī)制有密切關(guān)系[16，27]。酮脂酰羥甲基轉(zhuǎn)移酶PanB參與結(jié)核分枝桿菌體內(nèi)泛酸的生物合成，而泛酸與乙酰輔酶A的合成有關(guān)，乙酰輔酶A參與脂肪酸代謝和TCA循環(huán)[15，28]。磷酸肌醇合酶Ino1對結(jié)核分枝桿菌的硫醇和細(xì)胞壁脂聚糖的形成有重要作用，Movahedzadeh[29]等構(gòu)建了缺乏基因編碼Ino1的結(jié)核分枝桿菌突變體，結(jié)果顯示結(jié)核分枝桿菌的Ino1突變體很難在巨噬細(xì)胞和小鼠體內(nèi)長期生存。另一個重要的底物蛋白異檸檬酸裂解酶Icl，該酶是乙醛酸循環(huán)途徑中的關(guān)鍵酶，它的催化作用是為在醋酸鹽或含有某些脂肪酸的培養(yǎng)基上生長的結(jié)核分枝桿菌提供了碳源。正常體外培養(yǎng)條件下，Icl被降解，在體外缺氧條件下Icl的表達(dá)升高；Icl的缺失在感染急性期并不影響結(jié)核分枝桿菌的生長，但巨噬細(xì)胞的生存明顯減弱，降低了結(jié)核分枝桿菌的持留能力和致病性[30-31]。過氧化物岐化酶SodA，高致病性的結(jié)核分枝桿菌中過氧化物岐化酶SodA的表達(dá)水平比非致病性的結(jié)核分枝桿菌高93倍[32]；說明SodA與結(jié)核分枝桿菌的致病性密切相關(guān)，可能參與抗宿主免疫作用。結(jié)核分枝桿菌反應(yīng)調(diào)節(jié)器MtrA緊密聯(lián)系著細(xì)菌的清除，當(dāng)結(jié)核分枝桿菌感染小鼠或巨噬細(xì)胞后，高表達(dá)的MtrA可以加速結(jié)核分枝桿菌的清除，但在體外培養(yǎng)基中高表達(dá)的MtrA不影響結(jié)核分枝桿菌菌株的正常生長[33]。由此說明，上述底物蛋白和結(jié)核分枝桿菌的致病性均有密切關(guān)系，蛋白酶體通過對這些蛋白的調(diào)控，使結(jié)核分枝桿菌能夠在各種復(fù)雜的環(huán)境下維持其生理功能并致病。在不同的生長環(huán)境下Pup會選擇性標(biāo)記不同的蛋白，鑒于這些結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)底物蛋白的生理功能，結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)可以通過調(diào)控蛋白質(zhì)降解在結(jié)核分枝桿菌的生長調(diào)控和致病性中發(fā)揮重要作用。

5 結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體抑制劑與致病性的關(guān)系

結(jié)核分枝桿菌的蛋白酶體是一些蛋白降解所必需的成分[9]，對于在小鼠體內(nèi)的持留[7]以及對體外氮氧化物壓力下結(jié)核分枝桿菌的存活[34]都起到至關(guān)重要的作用。有研究證實蛋白酶體可作為新型藥物的作用靶標(biāo)[8]；而近期研究發(fā)現(xiàn)了化合物oxathiazol-2-one和天然物質(zhì)Fellutamide B，兩者都具有抑制結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體的功能。oxathiazol-2-one可以在不損傷細(xì)胞情況下有效的抑制結(jié)核分枝桿菌中蛋白酶體的功能，而且是不可逆的[35]；在對oxathiazol-2-one的結(jié)構(gòu)分析時發(fā)現(xiàn)該抑制劑是直接通過改變結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體的蛋白水解酶活性位點來阻斷其降解蛋白質(zhì)功能的[36]。Fellutamide B是迄今為止最有力的結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體抑制劑； 研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ellutamide B在不但可以抑制結(jié)核分枝桿菌20S，而且同時可以抑制蛋白酶體；結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體絡(luò)合時，F(xiàn)ellutamide B疏水尾部的部分的靈活性表明，尾部較短，可能會進(jìn)一步提高其對結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體功能的約束力[37]。如果蛋白酶體抑制劑發(fā)揮作用，蛋白酶體的功能受到限制，Pup標(biāo)記的底物逐漸累積，導(dǎo)致基因表達(dá)的間接改變，將會大幅度減弱結(jié)核分枝桿菌抗外界的壓力和其致病性的能力。最近研究證實，抑制劑可以有效對抗多種有毒力的廣泛耐藥的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株[38]。而且能穿透結(jié)核分枝桿菌并在硝化應(yīng)激反應(yīng)下殺死非復(fù)制的結(jié)核分枝桿菌[39]。這也進(jìn)一步說明蛋白酶體抑制劑可以通過抑制蛋白酶體的功能來降低結(jié)核分枝桿菌的致病性。

6 展 望

迄今為止，對結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制的研究尚處在探索階段。結(jié)核病的防治仍面臨著巨大的困難。結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)與結(jié)核分枝桿菌的致病性密切相關(guān)，但對于結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)的研究還處于初步階段，仍需要大量的研究來進(jìn)一步揭示結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌致病過程中的作用和機(jī)制。Pup-蛋白酶體系統(tǒng)的研究為結(jié)核分枝桿菌致病機(jī)制的研究提供新的方向，對Pup標(biāo)記的底物蛋白和蛋白酶體抑制劑的研究，都將有可能成為抗結(jié)核病的新的藥物靶標(biāo)。尋找新的更有效的抗結(jié)核藥物作用靶點對于結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病的治療已刻不容緩。深刻認(rèn)識 Pup-蛋白酶體系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制為結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的方向。

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