張潔潔，彭 軍

（中南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，湖南長沙 410078）

NADPH氧化酶激活機(jī)制和病理意義

張潔潔，彭 軍

（中南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，湖南長沙 410078）

活性氧影響許多生理過程，包括宿主防御能力、激素合成和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。因活性氧過量而引起的氧化應(yīng)激涉及高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病、心肌肥厚、心衰、缺血再灌注損傷、腦卒中和慢性腎病等許多疾病的發(fā)生和病理過程。NADPH氧化酶是機(jī)體促活性氧生成的主要酶類之一。NADPH氧化酶的激活很復(fù)雜，其活性受蛋白激酶、磷脂酶、肌動蛋白、皮質(zhì)肌動蛋白（皮動蛋白）、冠蛋白和脂質(zhì)筏等的調(diào)節(jié)。NADPH氧化酶活性的增高還涉及基因表達(dá)水平的上調(diào)。因此，闡明NADPH氧化酶活性調(diào)節(jié)機(jī)制將為心血管等疾病的藥物防治提供新思路。本文就NADPH氧化酶活性調(diào)節(jié)機(jī)制研究進(jìn)展作一綜述

NADPH氧化酶；蛋白激酶；磷脂酶；肌動蛋白；皮動蛋白

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．01．021

活性氧是指化學(xué)性質(zhì)活潑、含有氧功能基團(tuán)的化合物，包括超氧陰離子（）、過氧化氫羥自由基（·OH）、氫過氧化物（HOO·）和次氯酸（HOCl）等。研究表明，一定水平的活性氧對于維持機(jī)體正常的生理功能具有重要意義，而過量水平的活性氧則會對機(jī)體造成氧化損傷［1－2］。機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生活性氧的途徑很多，其中包括線粒體呼吸鏈和促氧化酶類。NADPH氧化酶是機(jī)體促活性氧生成的主要酶類之一，其活性變化對局部組織器官乃至全身活性氧水平的高低具有重要影響，本文就NADPH氧化酶活性調(diào)節(jié)機(jī)制研究進(jìn)展作一綜述。

1 NADPH氧化酶的亞型、分布和生理功能

在哺乳動物中，已被確認(rèn)的NADPH氧化酶的7個亞型分別是Nox1，Nox2，Nox3，Nox4，Nox5，Duox1和Duox2［3］。據(jù)報道，Nox1主要在結(jié)腸組織、HT29結(jié)腸的上皮細(xì)胞瘤細(xì)胞株［4］、子宮、前列腺以及血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，其生理功能主要是細(xì)胞增殖以及血管原的轉(zhuǎn)換器。Nox2主要在吞噬細(xì)胞、內(nèi)皮和動脈外膜細(xì)胞中表達(dá)，其生理功能主要是免疫防御、氧感受器和血壓調(diào)節(jié)。Nox3主要在內(nèi)耳、胎腎以及癌癥細(xì)胞系HepG2表達(dá)，其生理功能主要是影響胎腎的發(fā)育。Nox4主要在腎、內(nèi)皮細(xì)胞、心臟、骨骼肌以及大腦中表達(dá)，其生理功能主要是紅細(xì)胞生成素合成的調(diào)節(jié)和氧感受器。Nox5主要在淋巴組織和睪丸中表達(dá)，其生理功能主要是鈣依賴性活性氧的產(chǎn)生。Duox1和Duox2主要在甲狀腺、支氣管、呼吸道上皮細(xì)胞中表達(dá)，其生理功能主要與甲狀腺激素合成有關(guān)。

2 NADPH氧化酶的激活機(jī)制

NADPH氧化酶是一個包含膜結(jié)合細(xì)胞色素b558（p22phox和gp91phox異源二聚體）和細(xì)胞溶質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白（p67phox，p47phox，p40phox和Rac2 GTP酶）的多組分酶［5］，其激活機(jī)制很復(fù)雜，涉及到細(xì)胞溶質(zhì)的p47phox，p67phox，Rac以及膜相關(guān)組分Nox2和p22phox的組裝。

2．1 蛋白激酶與NADPH氧化酶的激活

多種蛋白激酶可通過蛋白磷酸化機(jī)制激活NADPH氧化酶。蛋白激酶C可通過磷酸化p40phox激活NADPH氧化酶［6］；一些絲氨酸激酶，如蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）及PKB和p21-激活蛋白激酶（p21-APK）則能夠激活p47phox［7］；高氧激活肺內(nèi)皮NADPH氧化酶則涉及p47phox的酪氨酸磷酸化，ERK和p38MAPK等激酶被報道介導(dǎo)了這一過程［8］。蛋白激酶激活NADPH氧化酶這一作用被相應(yīng)抑制劑所證實(shí)，如PKC抑制劑GF109203X能夠減弱p47phox和活性氧的產(chǎn)生［5］。JNK抑制劑SP600125則能抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中p47phox磷酸化［8］，而高氧誘導(dǎo)的p47phox的酪氨酸磷酸化則能夠被Src抑制劑PP2減弱［6］。

肌球蛋白輕鏈激酶主要在調(diào)節(jié)肌球蛋白輕鏈磷酸化方面發(fā)揮作用。然而，近年來有文獻(xiàn)報道，肌球蛋白輕鏈激酶在高氧誘導(dǎo)的皮動蛋白，Src和p47phox移位及活性氧的生成中起重要作用。與上述的蛋白激酶不同，肌球蛋白輕鏈激酶可能通過間接途徑激活NADPH氧化酶。已知細(xì)胞支架蛋白肌動蛋白和肌球蛋白所組成的蛋白平臺對NADPH氧化酶的集合和激活是必需的［9］，而肌球蛋白輕鏈激酶介導(dǎo)的肌球蛋白輕鏈磷酸化可影響該蛋白平臺的構(gòu)象變化進(jìn)而激活NADPH氧化酶。

2．2 磷脂酶與NADPH氧化酶的激活

在完整的中性粒細(xì)胞中，特異性受體配體相互作用啟動的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可調(diào)節(jié)激活3種類型的磷脂酶：磷脂酶A2，磷脂酶C和磷脂酶D。磷脂酶A2激活后可釋放花生四烯酸，它隨后通過環(huán)氧化酶/脂氧合酶轉(zhuǎn)化為氧化衍生物激活NADPH氧化酶；PIP2特異性磷脂酶C產(chǎn)生的甘油二酯能夠激活PKC，進(jìn)而通過磷酸化形式激活NADPH氧化酶［10］；磷脂酶D催化卵磷脂及其他膜磷脂水解為磷脂酸，磷脂酶D途徑產(chǎn)生的磷脂酸及磷脂酸隨后的代謝物甘油二酯調(diào)節(jié)吞噬性和非吞噬性NADPH氧化酶；組織和細(xì)胞通過磷脂酶D途徑產(chǎn)生的磷脂酸能夠激活蛋白激酶Cζ，進(jìn)而磷酸化p47phox或p67phox或p22phox。磷脂酸能夠調(diào)節(jié)NADPH氧化酶亞基和肌動蛋白結(jié)合蛋白之間的相互作用，從而改變肌動蛋白細(xì)胞骨架［11］。磷脂酶D介導(dǎo)的含有GTP酶激活蛋白1的IQ基序激活通過Rac1調(diào)節(jié)肺內(nèi)皮細(xì)胞高氧誘導(dǎo)的p47phox易位以及活性氧的產(chǎn)生［12］。

2．3 肌動蛋白與NADPH氧化酶的激活

肌動蛋白是細(xì)胞支架的主要組分，在吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞中大量出現(xiàn)。越來越多的研究表明，肌動蛋白在NADPH氧化酶的激活中起重要作用。細(xì)胞色素b558與肌動蛋白緊密相關(guān)，可與肌動蛋白和肌動蛋白相關(guān)蛋白共純化。研究表明，肌動蛋白聚合和解聚能增加小膠質(zhì)細(xì)胞中NADPH氧化酶的活性［13］；肌動蛋白與p47phox之間的相互作用能促進(jìn)NADPH氧化酶的激活和活性氧的產(chǎn)生，這個過程依賴于Src介導(dǎo)的肌動蛋白的酪氨酸磷酸化以及Src和肌動蛋白的結(jié)合［12］；壓力刺激血管平滑肌細(xì)胞時，抑制平滑肌22α表達(dá)將引起肌動蛋白細(xì)胞支架和微管骨架重構(gòu)，從而導(dǎo)致線粒體故障和NADPH氧化酶激活［14］。

2．4 皮動蛋白、冠蛋白與NADPH氧化酶的激活

皮質(zhì)肌動蛋白（皮動蛋白，cortactin）是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，它是c-Src信號通路的一個特異性下游靶點(diǎn)，在調(diào)節(jié)NADPH氧化酶集合中起重要作用。此外，皮動蛋白是公認(rèn)的腳手架蛋白，能使肌動蛋白結(jié)合到細(xì)胞溶質(zhì)的p47phox蛋白［15］。高氧可激活肺內(nèi)皮細(xì)胞NADPH氧化酶并產(chǎn)生活性氧，這一過程由p47phox和皮動蛋白的Src依賴性酪氨酸磷酸化完成［9］。高滲血癥可激活NADPH氧化酶，促進(jìn)活性氧的形成，這一過程可能涉及到皮動蛋白磷酸化的增加［16］。

冠蛋白（coronin）是肌動蛋白結(jié)合蛋白的一高度保守家族，它調(diào)節(jié)肌動蛋白依賴的過程，如細(xì)胞運(yùn)動和內(nèi)吞作用［17］。冠蛋白與NADPH氧化酶的細(xì)胞溶質(zhì)組分p40phox和p67phox相互作用，干預(yù)移位到吞噬體的過程［18］。在中性粒細(xì)胞中，磷酸化的p47phox蛋白使PKC適當(dāng)定位，導(dǎo)致冠蛋白磷酸化，對NADPH氧化酶活性的調(diào)節(jié)具有正反饋?zhàn)饔茫?8］。

2．5 脂質(zhì)筏與NADPH氧化酶的激活

脂質(zhì)筏（lipid raft）是在應(yīng)答刺激時，膽固醇、糖脂、磷脂和信號蛋白在細(xì)胞膜上聚集形成的物理信號平臺。研究表明，脂質(zhì)筏通過觸發(fā)NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基的集合在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的NADPH氧化酶激活中起重要作用［19］。脂質(zhì)筏的一個完整組分小窩蛋白（caveolin）-1，在血管緊張素Ⅱ刺激血管平滑肌細(xì)胞后的Rac1和NADPH氧化酶的激活中是必要的。窩芽觸發(fā)NADPH氧化酶后，NADPH氧化酶聚集在脂質(zhì)筏［20］。有研究表明，白細(xì)胞介素1β具有刺激Nox2和白細(xì)胞介素1受體1從血漿膜進(jìn)入早期內(nèi)含體的共內(nèi)吞作用，脂質(zhì)筏可以維持它們在早期內(nèi)含體內(nèi)的完整性，NADPH氧化酶激活時，Nox2的組分（p47phox和p67phox）聚集到脂質(zhì)筏［21］。

3 NADPH氧化酶表達(dá)的變化

NADPH氧化酶活性的增高還涉及基因表達(dá)水平的上調(diào)，如高膽固醇血癥NADPH氧化酶亞基p67phox，p47phox和Nox2的表達(dá)上調(diào)［22］，而高血壓和動脈粥樣硬化等則Nox1和（或）Nox2 m RNA和蛋白表達(dá)增加［23］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注時，Nox2基因表達(dá)顯著上調(diào)，伴隨活性氧水平升高，Nox4基因表達(dá)雖然有增加趨勢，但未達(dá)到顯著水平，提示Nox2在介導(dǎo)心肌缺血再灌注氧化損傷中起主要作用［24］；在氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中，NADPH氧化酶亞基gp91phox表達(dá)上調(diào)，通過NADPH氧化酶／活性氧／p38 MAPK／胱天蛋白酶3通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［25］。有關(guān)NADPH氧化酶基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制則有待深入系統(tǒng)研究。

4 展望

NADPH氧化酶的過度激活是氧化應(yīng)激水平升高的重要機(jī)制，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，NADPH氧化酶抑制劑在抑制氧化應(yīng)激方面具有潛在的臨床應(yīng)用價值。目前，已開發(fā)出多種NADPH氧化酶抑制劑，如二苯基氧化碘鹽、夾竹桃麻素（apocynin）、gp91ds-tat和AEBSF等，但多數(shù)為非特異性抑制劑。最近有文獻(xiàn)報道，新型NADPH氧化酶抑制劑VAS2870和VAS3947等為特異性抑制劑［26－27］，但其特異性程度還有待進(jìn)一步證實(shí)。此外，抑制NADPH氧化酶基因表達(dá)是降低NADPH氧化酶活性的另一條途徑，但這方面的進(jìn)展還有賴于闡明NADPH氧化酶基因的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制。

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Mechanism s and pathological significance of activation of NADPH oxidase

ZHANG Jie-jie，PENG Jun
（Department of Pharmacology，School of Pharmaceutic Science，Central South University，Changsha 410078，China）

Reactive oxygen species（ROS）affect many physiological processes including host defense，hormone biosynthesis and cellular signaling．Over-production of ROS（referring to oxidative stress）is involved in various pathological processes including multiple diseases，such as atherosclerosis，cardiac hypertrophy，ischemia-reperfusion injury，hypertension，diabetes，stroke and heart failure．NADPH oxidase（Nox）is one of the major enzymes to promote the generation of ROS．The mechanisms for activation of Nox are very complicated，which are regulated by multiple factors such as protein kinases，phospholipases，actin，cortactin，coronin，and lipid rafts．The increase of gene expression is also involved in Nox activation．Therefore，elucidation of the regulatory mechanisms for Nox activation will provide new insights into the prevention and therapy of cardiovascular diseases．

NADPH oxidase；protein kinases；phospholipases；actin；cortactin

PENG Jun，E-mail：Junpeng＠csu．edu．cn，Tel：（0731）82355080

R363

A

1000-3002（2014）01-0139-04

Foundation item：The project supported by Doctoral Fund of Ministry of Education of China（20120162110056）；and Hunan Provincial Natural Science Foundation of China（13JJ2008）

2013-06-17 接受日期：2013-08-20）

（本文編輯：喬 虹）

教育部博士點(diǎn)基金（20120162110056）；湖南省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（13JJ2008）

張潔潔（1987－），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樾难芩幚韺W(xué)，E-mail：zhangjie＿jie198825＠126．com；彭 軍（1968－），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事心血管藥理學(xué)研究。

彭 軍，E-mail：junpeng＠csu．edu．cn，Tel：（0731）82355080；Fax：（0731）82355078