王 雪，王希敏，劉可春，劉 新，韓利文，彭維兵，何秋霞，侯海榮

（山東省科學(xué)院生物研究所，山東濟(jì)南 250014）

斑馬魚(yú)胚胎在腎毒性損傷研究中的應(yīng)用進(jìn)展

王 雪，王希敏，劉可春，劉 新，韓利文，彭維兵，何秋霞，侯海榮

（山東省科學(xué)院生物研究所，山東濟(jì)南 250014）

腎是機(jī)體的主要排泄器官，極易受到體內(nèi)外各種化合物的毒性影響而引起腎功能損害，預(yù)防和治療中毒性腎損傷及腎功能衰竭逐漸成為研究的熱點(diǎn)。斑馬魚(yú)胚胎在腎形態(tài)、生理和功能等方面在脊椎動(dòng)物間高度保守，對(duì)化合物處理的反應(yīng)與人類(lèi)高度相似，是理想的腎毒性研究動(dòng)物模型。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于斑馬魚(yú)胚胎腎毒性損傷方面的研究已有少量報(bào)道，對(duì)腎損傷的評(píng)價(jià)涉及形態(tài)學(xué)、病理結(jié)構(gòu)及分子水平等不同層面。由于可直接在活體胚胎觀察腎和細(xì)胞形態(tài)的細(xì)微變化，熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)在腎損傷研究中得到日益廣泛的應(yīng)用。

斑馬魚(yú)；胚胎；腎；毒性作用；模型，動(dòng)物

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．01．020

腎是機(jī)體的重要器官，能排出體內(nèi)代謝產(chǎn)物及某些廢物、毒物，調(diào)節(jié)機(jī)體水、電解質(zhì)平衡，保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。作為機(jī)體的主要排泄器官，腎極易受到體內(nèi)各種代謝廢物、毒物的影響，這些物質(zhì)往往具有潛在的腎毒性。隨著社會(huì)發(fā)展，金屬、冶煉業(yè)、化工企業(yè)增多，加之醫(yī)藥及各種農(nóng)藥的濫用，環(huán)境污染日益加重，人群接觸腎毒性物質(zhì)的機(jī)會(huì)增加，中毒性腎病的發(fā)病率大幅增長(zhǎng)。臨床上腎毒物質(zhì)導(dǎo)致的腎損傷，常表現(xiàn)為急性腎功能衰竭（acute renal failure，ARF），約占ARF的5%～25%。ARF起病兇險(xiǎn)，死亡率高，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。長(zhǎng)期以來(lái)，人類(lèi)一直在不斷研究毒性腎損傷的致病機(jī)制和發(fā)病規(guī)律，積極尋找有效的預(yù)防和治療藥物。

目前關(guān)于腎毒性損傷方面的研究在動(dòng)物模型上已開(kāi)展較多，多數(shù)選用大鼠［1］、小鼠［2］、家兔［3］等哺乳動(dòng)物，利用這些動(dòng)物模型能很好地重現(xiàn)人類(lèi)腎毒性損傷的典型癥狀和表現(xiàn)，但存在費(fèi)用高、周期長(zhǎng)、效率低等問(wèn)題，而且無(wú)法在活體動(dòng)物直接觀察腎形態(tài)。斑馬魚(yú)是一種理想的脊椎模式生物，其基因組與人類(lèi)基因組高度相似，已逐漸在發(fā)育生物學(xué)、化合物毒性評(píng)價(jià)和人類(lèi)疾病模型研究等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。與其他動(dòng)物模型比，斑馬魚(yú)具有產(chǎn)卵量大、發(fā)育周期短、藥物用量少的優(yōu)點(diǎn)，更適用于大規(guī)模活性成分的篩選。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于化合物引起斑馬魚(yú)胚胎腎毒性損傷的研究已有少量報(bào)道，多集中于腎發(fā)育毒性方面，本文就此作一綜述。

1 斑馬魚(yú)胚胎在腎毒性損傷研究中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

斑馬魚(yú)胚胎受精后14 h（14 hours，14 hp f）腎開(kāi)始發(fā)育，72 hpf時(shí)腎發(fā)育完成［4］。最早在48 hp f可以觀察到腎小球?yàn)V過(guò)現(xiàn)象［5］。斑馬魚(yú)發(fā)育第1周內(nèi)，由于鰓還未發(fā)育完全，主要依賴(lài)腎排出體內(nèi)多余的水分和代謝廢物［6］，加之此階段仔魚(yú)不必喂食即可存活，干擾因素少，非常有利于開(kāi)展腎毒性相關(guān)的研究。斑馬魚(yú)腎分為幼魚(yú)期的前腎和成魚(yú)期的中腎，前腎由一對(duì)腎單位組成，腎小球在背主動(dòng)脈腹側(cè)的胚胎正中線處融合，腎小管分居兩側(cè)［7］。前腎的解剖結(jié)構(gòu)比成魚(yú)的中腎及哺乳動(dòng)物的后腎簡(jiǎn)單，但在細(xì)胞組成及分子水平上與哺乳動(dòng)物的腎相似，并已具備同樣復(fù)雜的生物功能［8］，許多腎毒性化合物引起斑馬魚(yú)胚胎腎損傷的表現(xiàn)與人類(lèi)的表現(xiàn)相似［9］，在斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果可應(yīng)用于人類(lèi)及其他模型。同時(shí)作為整體動(dòng)物模型，選用斑馬魚(yú)胚胎非常利于研究毒性損傷時(shí)腎組織內(nèi)腎小管、血管與免疫細(xì)胞間的聯(lián)系及相互作用規(guī)律［10］。另外，腎與心臟在功能上緊密相關(guān)、相互影響［11］，對(duì)斑馬魚(yú)胚胎心臟形態(tài)及功能的觀察簡(jiǎn)便易行，便于在腎毒性研究中綜合考察心功能因素的影響。

2 斑馬魚(yú)胚胎腎毒性損傷的評(píng)價(jià)

2．1 形態(tài)變化

斑馬魚(yú)胚胎體形小、胚體透明，在鏡下可清楚觀察胚胎整體或局部一些器官的形態(tài)變化，斑馬魚(yú)胚胎在形態(tài)學(xué)觀察方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。研究中胚胎經(jīng)腎毒性化合物處理后，胚胎出現(xiàn)局部水腫（心包水腫［9］、眼水腫［12］和腦水腫［12］等）或全身水腫表現(xiàn)，與對(duì)照組比，處理組胚胎對(duì)環(huán)境滲透壓的適應(yīng)能力下降，在低滲環(huán)境中更容易形成水腫［9］，提示腎排水功能受到損害，調(diào)節(jié)體液平衡能力下降。利用腎熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，可直接在熒光顯微鏡下觀察活體胚胎的腎形態(tài)。斑馬魚(yú)Wt1b基因是Wt1的同系物，高表達(dá)于前腎管、前腎弓和腎小球，與腎發(fā)育及再生修復(fù)有關(guān)［13］，是腎發(fā)育的標(biāo)志因子。Ding等［14］研究中用馬兜鈴酸10 mg·L－1處理Tg（wt1b∶GFP）斑馬魚(yú)胚胎24 h，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，胚胎出現(xiàn)前腎管、前腎弓囊性變及腎小球萎縮等形態(tài)異常改變（圖1）。

圖1 馬兜鈴酸（10 mg·L－1）處理后斑馬魚(yú)胚胎腎形A：正常斑馬魚(yú)胚胎（48 hp f）的腎；B：斑馬魚(yú)胚胎腎形態(tài)輕度異常，出現(xiàn)前腎管和前腎弓彎曲和囊性變，但腎小球形態(tài)正常；C：斑馬魚(yú)胚胎腎形態(tài)嚴(yán)重畸形，除前腎管和前腎弓異常外，出現(xiàn)腎小球萎縮和囊性變．pt：前腎管；pd：前腎弓；gl：腎小球．

2．2 病理學(xué)改變

斑馬魚(yú)胚胎腎的腎小球由血管球和包被于其周?chē)腂owman囊組成，結(jié)構(gòu)整齊、致密，前腎管由單層上皮細(xì)胞包圍形成一定大小的腎小管腔，正常組織結(jié)構(gòu)是維持腎功能的基礎(chǔ)。橘霉素（citrinin，CTN）和棒曲霉素（patulin，PAT）為真菌次生代謝物，存在于食品及飼料中，對(duì)動(dòng)物多個(gè)器官具有毒性作用。Wu［15］等以斑馬魚(yú)胚胎為模型研究CTN和PAT的腎毒性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)CTN和PAT處理后的胚胎腎小球?yàn)V過(guò)率（glomerular filtration rate，GFR）降低，切片觀察發(fā)現(xiàn)腎出現(xiàn)腎小球囊性變和腎小管上皮細(xì)胞排列紊亂、刷狀緣被破壞等病理改變，但腎形態(tài)并無(wú)明顯異常。在人類(lèi)和其他哺乳動(dòng)物，氨基糖苷類(lèi)抗生素主要損害腎的腎小球和近端小管，Hentschel等［9］在研究中向胚胎注射氨基糖苷類(lèi)抗生素，胚胎出現(xiàn)腎小球與腎小管囊腫、白細(xì)胞滲漏和管周聚集及腎小管內(nèi)細(xì)胞碎片的積聚等腎損傷表現(xiàn)，這些都是人急性腎衰時(shí)的典型組織學(xué)特征。Na＋／K＋-ATP酶是維持動(dòng)物細(xì)胞膜兩側(cè)的Na＋和K＋濃度梯度的膜結(jié)合酶，其α1亞單位在腎有高表達(dá)，為前腎管上皮細(xì)胞的標(biāo)志物，腎毒性研究中利用其抗體α6F對(duì)整個(gè)胚胎或切片進(jìn)行免疫染色，有助于腎定位及上皮細(xì)胞形態(tài)觀察［16－17］。

2．3 腎小球?yàn)V過(guò)率

腎小球的濾過(guò)屏障由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基底膜和足細(xì)胞的指狀突構(gòu)成，能濾過(guò)一些小分子、離子和液體成分。除病理改變外，腎損傷同時(shí)伴有GFR下降。GFR是反映腎功能的一個(gè)量化指標(biāo)。斑馬魚(yú)胚體透明，在鏡下可清楚觀察血液循環(huán)。據(jù)報(bào)道，將熒光素（FITC）標(biāo)記的右旋糖酐經(jīng)胚胎心臟竇靜脈注入循環(huán)血液內(nèi)，于注射后不同時(shí)間測(cè)量心臟區(qū)域或眼睛瞳孔處的熒光強(qiáng)度，計(jì)算其衰減速率，以此估算GFR［18－19］。Shannon等［20］選用菊粉（inulin）作為清除物，與右旋糖酐一樣，這些檢測(cè)物質(zhì)都具有在體內(nèi)不分解，不與蛋白結(jié)合，能自由通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)屏障，且不被腎小管分泌或重吸收的特點(diǎn)。除與濾過(guò)屏障功能狀態(tài)有關(guān)外，GFR還受腎血流量影響，心輸出量降低時(shí)濾過(guò)率下降，因此計(jì)算GFR時(shí)要注意排除斑馬魚(yú)胚胎心功能因素的影響［18］。

2．4 胚胎體內(nèi)肌酐含量

肌酐是肌肉的代謝產(chǎn)物，由前體化合物磷酸肌酸轉(zhuǎn)化而成，主要由腎排出體外。腎功能受損時(shí)，肌酐在體內(nèi)蓄積成為有害毒素，血清肌酐值升高，臨床上檢測(cè)血清肌酐值是了解腎功能的重要指標(biāo)。目前已有的肌酐測(cè)定方法有Jaffe法、酶法、電泳法［21］、液相色譜法［22］和同位素稀釋質(zhì)譜法［23］等。但這些方法均以血清或尿液為樣本，目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)組織樣本中肌酐含量進(jìn)行測(cè)定的研究未見(jiàn)報(bào)道。疾病導(dǎo)致機(jī)體病理生理發(fā)生變化，必然引起組織中代謝組分的變化，作為一類(lèi)小分子代謝產(chǎn)物，組織內(nèi)肌酐水平與腎功能狀態(tài)密切相關(guān)。斑馬魚(yú)胚胎體形小，難以獲取血清或尿液樣本，在進(jìn)行腎毒性損傷研究時(shí)，有必要考察胚胎體內(nèi)的肌酐水平，以全面衡量腎功能狀態(tài)。Soanes等［24］利用代謝組學(xué)方法分析了斑馬魚(yú)胚胎體內(nèi)14種代謝組分在不同發(fā)育時(shí)期的含量變化，發(fā)現(xiàn)從胚胎發(fā)育15～48 hp f這一階段內(nèi)，包括肌酐在內(nèi)的部分與能量代謝相關(guān)的代謝物含量呈逐步上升趨勢(shì)，其研究中采用的組織提取方法取自于Wu等［25］的報(bào)道，他們的研究對(duì)斑馬魚(yú)胚胎組織中肌酐提取和測(cè)定方法的確立具有重要參考價(jià)值。

3 轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚(yú)在腎損傷研究中的應(yīng)用

隨著基因操作和顯微注射技術(shù)的成熟，目前已構(gòu)建了種類(lèi)繁多的熒光標(biāo)記斑馬魚(yú)品系，這些轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)可表達(dá)清晰、明亮的熒光，有利于觀察組織器官的精細(xì)變化。在腎相關(guān)研究中常用的Tg（wt1b∶GFP）斑馬魚(yú)胚胎，包括前腎管、前腎弓和腎小球在內(nèi)的整個(gè)腎顯示綠色熒光［14］，可直接觀察毒性物質(zhì)作用導(dǎo)致的腎形態(tài)變化。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)膜的重要組成部分，對(duì)維持正常腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能至關(guān)重要，目前已確立多個(gè)與腎疾病相關(guān)的足細(xì)胞特異突變基因［26－27］。Zhou等［12］研究中將硝基還原酶基因與足細(xì)胞podocin基因啟動(dòng)子連接，并連一熒光報(bào)告基因，構(gòu)建得到Tg（pod：NTR-mCherry）斑馬魚(yú)，在培養(yǎng)液中加入甲硝唑后，該Tg斑馬魚(yú)表達(dá)的硝基還原酶能將甲硝唑轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒化合物，特異性地誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，造成腎小球?yàn)V過(guò)屏障的破壞，利用此斑馬魚(yú)足細(xì)胞誘導(dǎo)損傷模型可進(jìn)行腎疾病和足細(xì)胞修復(fù)方面的研究，并可直接通過(guò)胚胎體內(nèi)熒光的強(qiáng)弱判斷足細(xì)胞的凋亡情況。腎小球?yàn)V過(guò)屏障遭到破壞后，一些大分子蛋白如白蛋白透過(guò)濾膜滲漏到腎小管內(nèi)而出現(xiàn)蛋白尿。為研究蛋白滲漏情況，Zhou等［12］將GFP融合到維生素D結(jié)合蛋白（vitamin D-binding protein，VDBP）的羧基端，并與脂肪酸結(jié)合蛋白基因（l-fabp）的啟動(dòng)子連接，構(gòu)建得到（l-fabp：VDBP-GFP）轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，能在肝內(nèi)表達(dá)綠色熒光標(biāo)記的融合蛋白并分泌入血液，其相對(duì)分子質(zhì)量及等電點(diǎn)與白蛋白接近，可替代白蛋白追蹤觀察蛋白滲漏、近端小管蛋白的重吸收及聚集情況。

4 展望

研究發(fā)現(xiàn)，化合物導(dǎo)致腎毒性損傷后，斑馬魚(yú)胚胎體內(nèi)包括促炎性因子［14－15］（如環(huán)氧合酶2，腫瘤壞死因子α，髓過(guò)氧化物酶和白細(xì)胞介素1β）、細(xì)胞凋亡因子［17］（p53，bcl-2）、致纖維化因子［28］、發(fā)育和修復(fù)相關(guān)因子［12］（W t1b）在內(nèi)的多種因子的表達(dá)量發(fā)生改變，說(shuō)明化合物引起的腎毒性損傷是涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、間質(zhì)纖維化等多種機(jī)制在內(nèi)的一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，并同時(shí)伴有腎的再生修復(fù)過(guò)程［12］。腎在形態(tài)、生理及功能等方面在不同脊椎動(dòng)物間具有高度保守性［29］，以斑馬魚(yú)胚胎為模型開(kāi)展腎毒性損傷發(fā)生、發(fā)展和恢復(fù)過(guò)程的研究，將有助于人們加深對(duì)中毒性腎功能損傷及腎功能衰竭的認(rèn)識(shí)，從而更好地預(yù)防腎損害的發(fā)生。深入研究腎損傷的分子機(jī)制、病理特點(diǎn)以及發(fā)生過(guò)程中相關(guān)因子的作用，也將為尋找能緩解和改善人類(lèi)腎損傷的治療藥物和治療方法提供可利用靶點(diǎn)。

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（本文編輯：付良青）

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Progress in application of zebrafish embryos in nephrotoxicity injury

WANG Xue，WNAG Xi-min，LIU Ke-chun，LIU Xin，HAN Li-wen，PENG Wei-bing，HE Qiu-xia，HOU Hai-rong
（Biology Institute of Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014，China）

As the main excretion organ，the kidney is vulneroble to the toxic insult of internal or external compounds．More and more research is focused on the prevention or therapy of nephrotoxicity injury．Nephron shape，physiology and function are remarkably conserved among vertebrates．Zebrafish respond to toxic compounds in prettymuch the same way as humans．So zebrafish is an ideal model for nephrotoxicity research．Currently，kidney injury is mainly evaluated through morphological，pathological and molecular changes in many researches on nephrotoxicity of zebrafish embryos．Transgenic zebrafish labeled with fluorescence are widely used in the direct observation of fine changes of the kidneys or cells in living embryos．

zebrafish；embryo；kidney；toxic actions；model，animal

LIU Ke-chun，E-mail：hliukch＠sdas．org，Tel：（0531）82605352

R965．1

A

1000-3002（2014）01-0134-05

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（81202584）

2013-08-20 接受日期：2013-11-21）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81202584）

王 雪，女，高級(jí)工程師，碩士，主要從事藥物毒理學(xué)研究。

劉可春，E-mail：hliukch＠sdas．org，Tel：（0531）82605352