葛 建，劉 洋，王夢馨，崔 林，韓寶瑜

（中國計量學院1．生命科學學院，2．浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室，浙江杭州 310018）

表沒食子兒茶精的小鼠急性肝損傷和代謝動力學的性別差異

葛 建1，2，劉 洋1，王夢馨1，崔 林1，韓寶瑜2

（中國計量學院1．生命科學學院，2．浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室，浙江杭州 310018）

目的從對表沒食子兒茶精（EGCG）藥物代謝動力學差異性角度，探索EGCG導致小鼠急性肝損傷的性別差異。方法小鼠ip給予EGCG 300 m g·kg－1后，采用試劑盒檢測小鼠血清酶谷丙轉氨酶（GPT）、乳酸脫氫酶（LDH）、琥珀酸脫氫酶（SDH）和鳥氨酸氨基甲酰轉移酶（OCT）的活性變化，熒光酶標儀檢測肝線粒體膜電位變化，反相高效液相色譜法分析EGCG的血藥濃度，熒光免疫組織化學法檢測小鼠肝細胞中羧酸酯酶Ⅱ含量。結果小鼠ip給予EGCG后，雌雄小鼠血清中GPT和LDH均顯著升高（P＜0．05），雌性較雄性小鼠升高顯著（P＜0．01），SDH和OCT活性變化均不顯著。雌性小鼠肝細胞線粒體膜電位變化較雄性小鼠顯著（P＜0．05）。HE肝組織學觀察顯示，雌性和雄性小鼠肝組織形態(tài)變化均不明顯。但電子顯微鏡組織學觀察表明，雌性小鼠肝細胞線粒體溶脹、裂解及電子密度增加均較雄性顯著。雄性小鼠較雌性對EGCG代謝迅速，消除半衰期較短。代謝酶鑒定結果表明，羧酸酯酶Ⅱ為EGCG發(fā)生水解反應的主要酶類。熒光免疫組織化學法研究表明，羧酸酯酶Ⅱ在雄性小鼠體內含量較雌性高。結論EGCG導致雌性小鼠急性肝損傷比雄性小鼠嚴重。

表沒食子兒茶精；急性肝毒性；毒物代謝動力學；性別差異

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．01．012

茶多酚為茶葉中的主要成分，占茶葉干重的18%～36%［1］。茶多酚的主要成分是兒茶素類化合物，其中以酯型表沒食子兒茶精（epigallocatechin gallate，EGCG）含量最高，占兒茶素的50%～60%。國內外大量研究表明，EGCG具有抗癌、抗突變、預防和治療心腦血管系統(tǒng)疾病以及調理內分泌、免疫系統(tǒng)和干預化學毒物引起的肝損傷和肝纖維化等生物活性［2－8］。EGCG對外源性化學毒物的解毒機制很可能通過調節(jié)核受體2介導的抗氧化和解毒作用［9］。體外研究表明，EGCG對細胞色素酶（CYP）類具有較強烈的抑制作用，從而導致部分藥物體內藥物代謝動力學過程的改變［10］。研究表明，EGCG能夠抑制卵巢芳香化酶活性，同時增強CYP3A和CYP2E1活性，但對雄性小鼠前列腺中芳香化酶未表現(xiàn)出明顯抑制作用［11］。

近年來研究表明，ip給予大劑量EGCG對肝損傷毒性較強，而且具有性別和種屬差異性［11］。因此，本研究在前人的基礎上，采用單劑量ip給予EGCG，進一步探索EGCG肝損傷機制，同時觀察EGCG在不同性別小鼠體內的藥代動力學差異性，鑒定EGCG在體內代謝酶以及酶活性的性別差異，從體內藥代動力學和代謝酶差異性的角度深入揭示兒茶素引起急性肝損傷性別差異性的機制，以期為兒茶素類化合物在醫(yī)藥領域的深層次應用和保健品研發(fā)提供理論依據(jù)和安全性參考。

1 材料與方法

1．1 試劑和儀器

EGCG標準品，購自杭州和田生物技術有限公司，批號：20101012，純度＞98%；色譜甲醇和色譜乙腈，均購自杭州米克化工儀器有限公司，其他試劑為分析純。羅丹明123，美國Sigm a公司。谷丙轉氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、琥珀酸脫氫酶（succinic dehydrogenase，SDH）和鳥氨酸氨基甲酰轉移酶（ornithine carbamyl transferase，OCT）試劑盒，購自南京建成生物工程有限公司。TECNAI10型透射電子顯微鏡，荷蘭FEI公司；MK-3臺式熒光檢測儀，荷蘭雷勃生物醫(yī)學有限公司；Shim adazu 20AT高效液相色譜系統(tǒng)，日本島津公司；N2000色譜工作站，浙江大學智達公司。

1．2 酶活性及線粒體膜電位的測定

雌性和雄性ICR小鼠300只，體質量23～27 g，由浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（浙）20080033，于本實驗室IVC獨立通氣籠中適應性飼養(yǎng)1周。將不同性別小鼠隨機分組，每組6只，分別ip給予EGCG 300 m g·kg－1，于注射前、注射后1和8 h采集血清，按照試劑盒說明書分別檢測GPT，LDH，SDH和OCT酶活性，生理鹽水為對照組。同時按照文獻［12］方法制備肝細胞線粒體懸液，羅丹明染色后，熒光酶標儀檢測熒光強度值，根據(jù)熒光強度值的變化判斷EGCG對小鼠線粒體膜電位損傷。

1．3 肝組織病理學檢查

切除小鼠肝左側葉邊緣部分，于10%甲醛溶液中固定48 h，石蠟包埋，制備5μm厚切片，HE染色后光學顯微鏡下觀察細胞結構變化。將小鼠肝組織（≤1 mm3）于2．5%戊二醛水溶液中固定2 h，PBS 0．1 m ol·L－1漂洗2次，1%鋨酸溶液染色1 h后，PBS再次漂洗，2%醋酸鈾漂洗，梯度乙醇溶液脫水，然后分別用無水乙醇和無水丙酮浸泡脫水，環(huán)氧樹脂包埋、聚合、切片、染色后于電子顯微鏡下觀察。

1．4 EGCG高效液相色譜分析法建立

參照文獻［13］EGCG定量檢測方法，采用色譜柱為大連伊利特Hypersil BDS C18柱（250 mm× 4．6 mm，5μm），流動相為乙腈∶0．1%枸櫞酸水溶液＝10∶90；柱溫30℃，波長280 nm；流速為1．0 m L·m in－1；進樣量為20μL，外標法定量。

精密吸取0．3 m L正常小鼠血漿，分別加入含EGCG系列工作液10μL，混勻后制成含EGCG濃度范圍0．1～200．0 m g·L－1的對照品血漿，分別向其中加入20%維生素C水溶液30μL，混勻后加入乙酸乙酯3 m L，渦漩1 m in，低溫離心5 m in后取出有機相于尖底玻璃離心管中，按上述方法重復萃取1次，合并有機相于氮氣流下40℃水浴揮干，向殘渣中加入0．1 m L 20%乙腈水溶液，3 181×g高速離心后取20μL行HPLC分析。按上述方法制備分別含EGCG 0．2，10．0和50．0 m g·L－1質控樣品，按照上述方法處理后進樣分析，每個濃度重復5次，以樣品中藥物與直接溶于流動相下峰面積比值，計算EGCG 0．2，10．0和50 m g·L－1濃度下提取回收率。比較以上樣品于日內5次和日間5次測定的峰面積變化，計算日內和日間精密度。同時將峰面積代入標準曲線方程，計算EGCG濃度，與加入濃度比較，求得方法回收率，用以表示分析方法準確度。

制備含EGCG 10．0和50．0 m g·L－1的血漿樣品，室溫保存，按照上述處理方法分別于0，1，3和7 h各一式3份進行測定；同時按照上述相同方法配制含EGCG 10．0和50．0 m g·L－1的血漿樣品于－20℃保存，分別于0，5，10和30 d各一式3份進行處理測定，計算不同保存條件和放置時間下EGCG濃度變化來反映樣品穩(wěn)定性。

1．5 計算EGCG血藥濃度和藥物代謝動力學參數(shù)

雌性和雄性ICR小鼠隨機分組，每組5只，單次ip給予EGCG 150 m g·kg－1，分別于注射后2，15，30 m in，1，2，4，8，12和18 h眼球取血，分離血漿，根據(jù)文獻［14］方法處理血漿樣品，按照1．4方法檢測不同時間點血漿中EGCG含量，繪制血藥濃度時間曲線，利用藥代動力學計算公式，計算藥代動力學參數(shù)。

1．6 EGCG代謝酶的鑒定

制備正常小鼠血漿，設生理鹽水組、毒扁豆堿組、普魯卡因胺組、辛硫磷組和洛哌丁胺組，分別向血漿中加入上述不同水解酶特異性抑制劑，終濃度為30 m g·L－1，混勻后向每組血漿中加入EGCG標準液，使得終濃度為50 m g·L－1，放入37℃水浴中反應0，5，10和30 m in，于不同時間點取樣檢測其中EGCG含量，根據(jù)EGCG濃度變化速率鑒定EGCG體內的主要代謝酶。

1．7 不同性別小鼠EGCG代謝酶活性的測定

向雌性和雄性小鼠血漿中加入一定濃度的EGCG，分別于37℃水浴中反應0，5，10和30 m in，于不同時間點取樣檢測其中EGCG含量，根據(jù)EGCG濃度變化速率來判斷不同性別小鼠血漿中代謝酶活性差異。

1．8 熒光免疫組織化學染色法檢測CES-Ⅱ蛋白表達

雌性和雄性小鼠的肝組織經約5%甲醛，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為6μm。切片脫蠟水化，枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復，加入一抗（CES-Ⅱ抗體），4℃冷藏2 h，室溫放置30 m in，PBS緩沖液沖洗后加入FITC標記的二抗，室溫孵育15 m in，PBS緩沖液洗片，封片，熒光顯微鏡觀察，出現(xiàn)綠色熒光者記為陽性細胞。

1．9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2．1EGCG對不同性別小鼠的急性肝損傷作用

小鼠大劑量單次ip給予EGCG后1和8 h，雌性和雄性小鼠血清中GPT，LDH，SDH和OCT活性與對照組相比均有所改變，其中雌性和雄性小鼠血清中GPT含量變化具有顯著性差異（P＜0．05），與文獻［11］報道結果相一致（表1）。同時肝細胞線粒體膜電位損傷研究結果顯示，ip給予EGCG后雌雄小鼠線粒體均受到顯著破壞，其中雌性小鼠損傷較雄性嚴重（圖1）。

Tab．1 Effect of epigallocatechin gallate（EGCG）on GPT，LDH，SDH and OCT activity in male and female lCR mice

Fig．1 Effect of EGCG on mitochondrial membrane potential in livers of male and female mice．See Tab．1 for mouse treatment．，n＝6．*P＜0．05，**P＜0．01，compared with female mice at the same time．

組織學檢查結果表明，EGCG所致急性毒性肝細胞結構未見明顯的肝壞死，肝索和肝血竇清晰可見（圖2）。電子顯微鏡觀察顯示，雌性小鼠肝細胞中線粒體明顯溶脹和溶解（圖3B），雄性小鼠線粒體損傷較雌性輕（圖3C）。

Fig．2 Effect of EGCG on liver morphological changes of male and female mice（HE×200）．See Tab．1 for the mouse treatment．A：normal control；B：male mice，8 h after administration of EGCG；C：female mice，8 h after administration of EGCG．

Fig．3 Effect of EGCG on subcellular structure of livers of male and female mice（×15 000）．See Tab．1 for the treatment．A：normal control；B：male mice，8 h after administration of EGCG；C：female m ice，8 h after administration of EGCG．Arrows show mitochondria in hepatocytes．

2．2 血漿中EGCG檢測方法

在本研究樣品的處理方法和色譜條件下，血漿在EGCG 0．1～200．0 m g·L－1范圍內，線性關系良好，在EGCG保留時間處無干擾峰出現(xiàn)（圖4）。利用線性回歸方程計算出斜率、截距以及相關系數(shù)。標準曲線方程為y＝12037x＋560．33（r＝0．9999）。EGCG在血漿中的回收率＞85．0%，日內和日間變異系數(shù)均＜10%，準確度＞95%，說明EGCG在小鼠血漿中回收率較好，精密度和準確度符合檢測要求（表2）。同時穩(wěn)定性檢測顯示EGCG 10．0和50．0 m g·L－1室溫保存的相對濃度分別為100．0%，98．5%，97．6%和96．9%以及100．0%，98．0%，96．6%和95．6%。－20℃保存的相對濃度分別為100．0%，100．2%，100．5%，99．5%和100．0%，99．8%，98．7%和97．0%。結果表明，室溫下樣品至少可以穩(wěn)定7 h，－20℃樣品至少可以穩(wěn)定30 d。

Fig．4 Chromatographs of EGCG in serum．A：EGCG standard；B：blank plasma；C：blank plasma spiked with EGCG；D：plasma chromatogram after administration；Peak 1：EGCG．

Tab．2 Plasm a recovery，accuracy and precision of EGCG in serum of mice

2．3 EGCG在雄性和雌性小鼠的藥代動力學的比較

圖5為血藥濃度和時間曲線圖。根據(jù)藥代動力學計算公式得出EGCG藥代動力學參數(shù)見表3。

結果顯示，EGCG在雄性小鼠體內半衰期較雌性短，清除率較雌性大，說明其在雄性小鼠體內代謝清除較雌性快。

Fig．5 Concentration-time curve of plasma EGCG in male and female mice．Mice were ip given EGCG 150 mg·kg－1，plasma was collected at0，2，15，30 min and 1，2，4，8，12，18 h，and plasma concentrations were determined by high performance liquid chromatography．，n＝5．

2．4 EGCG血清中的代謝酶

圖6結果表明，生理鹽水對照組代謝較迅速，毒扁豆堿組代謝與對照組相似，普魯卡因胺和洛哌丁胺組EGCG代謝曲線變化較平緩，說明可不同程度地抑制EGCG的代謝，辛硫磷組抑制最強烈，由于辛硫磷為酯酶類非特異性強烈抑制劑，普魯卡因胺和洛哌丁胺分別為羧酸酯酶Ⅰ和Ⅱ的特異性抑制劑。因此提示，EGCG在血漿中主要為羧酸酯酶Ⅰ和Ⅱ所代謝。

Tab．3 Pharmacokinetic parameters of EGCG 300 m g·kg－1in m ale and fem ale m ice

Fig．6 Metabolic inhibition of EGCG by different inhibitors．，n＝5．

2．5 不同性別小鼠EGCG代謝酶活性差異

圖7結果表明，EGCG在雄性小鼠血漿中代謝較雌性小鼠迅速。

Fig．7 In vitro metabolism of EGCG in plasma of male and female mice，n＝5．

2．6 不同性別小鼠肝細胞CES-Ⅱ蛋白表達差異

熒光免疫組織化學染色結果顯示，雌雄小鼠肝細胞中CES-Ⅱ表達量均較高（圖8），尤以肝小葉中央靜脈處含量最高。雌雄肝組織表達量比較表明，雄鼠肝組織中CES-Ⅱ的表達量明顯高于雌鼠肝組織，并與代謝酶活性檢測結果相一致。

Fig．8 Effect of EGCG on CES-Ⅱexpression in livers of male（A）and female（B）mice（×400）．

3 討論

本研究結果顯示，單劑量ip給予EGCG表現(xiàn)出明顯急性肝損傷，同時也具有明顯的性別差異性，與文獻研究結果相一致。本研究發(fā)現(xiàn)，EGCG引起肝損傷的主要部位為線粒體損傷，可能是EGCG作用于線粒體膜轉換蛋白，從而引起線粒體膜電位的顯著改變，進而表現(xiàn)出肝細胞損傷。至于EGCG導致線粒體膜轉換蛋白發(fā)生改變的機制有待進一步研究，根據(jù)文獻推斷有可能為EGCG干擾了肝細胞內鈣離子流的變化，從而導致細胞內離子泵的開放紊亂，引起肝細胞損傷［4］。

兒茶素類化合物藥代動力學研究結果也顯示，此類物質在體內生物利用度較低，主要表現(xiàn)在EGCG難以通過小腸上皮細胞進入循環(huán)系統(tǒng)［15］，而且進入血液中的EGCG又較易被水解代謝，從而使得經口服未見明顯毒性。然而，腹腔注射EGCG，其生物利用度較高，與靜脈注射相當，因此大劑量、長期腹腔或靜脈注射EGCG均能表現(xiàn)出明顯的毒性反應。本研究發(fā)現(xiàn)，EGCG在小鼠體內的主要代謝部位為血液，代謝反應主要為水解反應，由于EGCG為內酯型兒茶素，因此推斷血漿中酯酶可能為EGCG代謝的主要酶類，它們包括膽堿酯酶和羧酸酯酶兩大類。據(jù)文獻報道，肟硫磷為酯酶的非特異性抑制劑，毒扁豆堿為膽堿酯酶的特異性抑制劑，而普魯卡因胺和洛哌丁胺分別為羧酸酯酶Ⅰ和Ⅱ的特異性抑制劑［16－17］，本研究發(fā)現(xiàn)EGCG主要被羧酸酯酶所代謝，羧酸酯酶Ⅱ較酯酶Ⅰ對EGCG代謝強。根據(jù)EGCG結構可知，EGCG屬于“小?；罅u基”酯型化合物，此類化合物在體內主要為CES-Ⅱ水解，與抗癌藥伊立替康體內代謝結果相一致［18］。將此類抑制劑與兒茶素聯(lián)用，可降低EGCG在體內的水解代謝速率，從而延長其在體內的駐留時間，增加其藥理活性。

雌雄動物由于生理生化機制不同，往往表現(xiàn)在對外源性化合物的藥代動力學過程也明顯不同。有文獻報道，雷公藤甲素在雌雄大鼠體內表現(xiàn)出明顯的毒性差異，原因主要是它們對雷公藤甲素的代謝過程有差異［19］。研究EGCG體內藥代動力學的文獻大多限于體內吸收、分布、代謝和排泄過程，對不同性別代謝差異性研究未見報道，其差異性機制的研究更少。本研究在雌雄小鼠發(fā)現(xiàn)EGCG藥代動力學差異性可以解釋EGCG對雌雄小鼠肝損傷差異性機制。

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（本文編輯：付良青）

文獻類型標志符號含義及統(tǒng)計表的書寫原則

1．文獻類型標志如下：普通圖書M，會議錄C，匯編G，報紙N，期刊J，學位論文D，報告R，標準S，專利P，數(shù)據(jù)庫DB，計算機程序CP，電子公告EB。會議錄包括座談會、研討會、學術年會等會議的文集；匯編包括多著者或個人著者的論文集，也可標注為M。

電子文獻載體類型標志如下：磁帶MT，磁盤DK，光盤CD，聯(lián)機網絡OL。

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Gender role in acute hepatotoxicity and pharmacokinetics of epigallocatechin gallate in mice

GE Jian1，2，LIU Yang1，WANG Meng-xin1，CUILin1，HAN Bao-yu2
（1．College of Life Sciences，2．Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection＆Quarantine，China Jiliang University，Hangzhou 310018，China）

OBJECTlVETo investigate the possible mechanism and sex-dependence of hepatotoxicity induced by epigallocatechin gallate（EGCG）after administration by intraperitoneal injection．METHODSICR mice were ip given EGCG 300 m g·kg－1．Their plasma enzyme activity and mitochondrial membrane potential（MMP）were detected and used as indicators of hepatic dam age．Liver histology was examined by light and electron microscopy．Then，the sex-dependent toxicokinetics and expression of carboxylesteraseⅡwere both determined．RESULTSGlutamic-pyruvic transaminase（GPT）and lactate dehydrogenase（LDH）values significantly increased in serum of mice．GPT increased more significantly in female mice than in male mice．However，the succinic dehydrogenase（SDH）and ornithine carbamyl transferase（OCT）values in serum did not increase significantly between female and male mice．EGCG also contributed to the changes in MMP in the livers of female and male mice after intraperitoneal injection．MMP increased m ore in female mice than in male mice．Although liver slices stained with hematoxylin and eosin revealed few necrotic cells in male and female mice，liver his to logy examined by an electron microscope demonstrated that EGCG produced severe hepatic damage at the subcellular level．Sex-different toxicokinetics showed faster elimination of EGCG in male m ice than in female ones．EGCG was mainly metabolized by hydrolysis and carboxylesteraseⅡwas determined to be the main metabolic enzyme in m ice．Immunohistochemistry detection showed that the protein expression of carboxylesteraseⅡwas very lower in female mice than in male ones．CONCLUSlONEGCG produces more severe hepatotoxicity in female mice than in male ones．

epigallocatechin gallate；acute hepatotoxicity；toxicokinetics；sex difference

HAN Bao-yu，E-mail：hanbaoyu＠cjlu．edu．cn，Tel：（0571）86835706

R969．1

A

1000-3002（2014）01-0074-07

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（31100499）；National Natural Science Foundation of China（31071744）；and Zhejiang Provincial Innovative Research Team Project of Undergraduate in 2012

2013-03-18 接受日期：2013-08-21）

國家自然科學基金（31100499）；國家自然科學基金（31071744）；2012年浙江省大學生科研創(chuàng)新團隊資助（新苗人才項目）

葛 建（1979－），男，博士，副教授，從事天然產物毒理學及代謝動力學研究，E-mail：gejian16888＠163．com。

韓寶瑜，E-mail：hanbaoyu＠cjlu．edu．cn，Tel：（0571）86835706