許楚楚，夏 成，王朋賢，孫雨航，舒 適，李昌盛

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶163319）

近十多年來，我國奶牛集約化規(guī)?；B(yǎng)殖場不斷增加，單產(chǎn)水平不斷提高，繁殖障礙疾病發(fā)生率呈現(xiàn)增高趨勢。據(jù)統(tǒng)計，我國奶牛繁殖障礙發(fā)生率達20%～40%，其中產(chǎn)后乏情奶牛占繁殖障礙的26.68%；美國約有38%奶牛產(chǎn)后60～80 d不表現(xiàn)發(fā)情[1]。集約化牛場高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后乏情的現(xiàn)象更為普遍，乏情率可高達50%以上。據(jù)報道，1頭奶牛縮短一個空懷期可節(jié)約飼養(yǎng)費600多元人民幣，經(jīng)濟效益十分顯著。因此，乏情是高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后亟待解決的一個重要的繁殖障礙問題[2]。

奶牛乏情是指產(chǎn)后60～90 d未能發(fā)情配種的經(jīng)產(chǎn)母牛[3]。奶牛產(chǎn)后乏情主要分為兩種類型：（1）功能性不發(fā)情（也稱暗發(fā)情或隱性發(fā)情），即90%有發(fā)情周期而無外部表現(xiàn)；（2）真正的不發(fā)情（卵巢靜止），即無發(fā)情表現(xiàn)又無卵巢周期和排卵[4]。目前，卵巢靜止所致的乏情已成為高產(chǎn)母牛產(chǎn)后不孕的主要原因。非傳染性因素已成為其重要病因，主要涉及營養(yǎng)因素、體況、內(nèi)分泌、生殖器官等因素。實踐中單一因素致病的情況較少，往往是多種病因共同作用或協(xié)同作用的結(jié)果[5]。這些因素通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)傳遞信號到生殖系統(tǒng)，最終導致生殖激素紊亂,引起奶牛乏情。

1 奶牛產(chǎn)后乏情的研究現(xiàn)狀

1.1 奶牛產(chǎn)后乏情的原因（1）能量平衡因素：日糧中蛋白、能量、維生素、礦物元素等營養(yǎng)成分的均衡搭配是機體維持生殖機能正常的必要條件。其中日糧能量水平對發(fā)情周期、胚胎質(zhì)量和受胎率的影響較大[6]。奶牛在能量負平衡，體重下降期間，促卵泡素分泌頻率降低，活動卵泡直徑減少，乏情比率高，配種受胎率低。研究顯示，產(chǎn)后發(fā)情周期的開始與產(chǎn)后能量負平衡最低點出現(xiàn)的時間密切相關[7]。產(chǎn)后能量負平衡很快回到正平衡的母牛，發(fā)情及受胎較快較早，反之較晚。飼料攝入是影響產(chǎn)后能量平衡的一個主要因素。產(chǎn)后能量平衡變化主要與干物質(zhì)攝入量有關，而與泌乳量關系尚不確定[8]。然而，高產(chǎn)奶牛乏情比率高是一個不爭的事實。因此，探討泌乳量、干物質(zhì)攝入對產(chǎn)后奶牛代謝和生殖機能的調(diào)控作用，對闡明奶牛產(chǎn)后乏情的發(fā)生機制是十分必要的；（2）體況因素：它是指其體內(nèi)所貯備的脂肪量或能量的水平，是奶牛健康、高產(chǎn)和高繁的標志之一。體況評分（Body Condition Score，BCS）是衡量奶牛體組織儲存狀況及監(jiān)控奶牛能量平衡的一種數(shù)字化評定方法。最常用的是美國5分制體系[9]。研究表明，懷孕后期、產(chǎn)犢及泌乳早期的能量儲備會影響產(chǎn)后發(fā)情周期和懷孕的成功率。產(chǎn)犢時BCS接近3.5的牛，產(chǎn)后頭5周體況分下降不到0.5分的母牛產(chǎn)奶量、健康狀況及繁殖力較好[10]。研究顯示，胰島素和胰島素樣生長因子（Insulin-like Growth Factor IGF）；IGF可直接作用于卵巢，同時也能直接作用于子宮和胚胎。胰島素和IGF可能是影響體況形成的因素。這些體況涉及子宮、胚胎、卵泡的發(fā)育和排卵[11]。體況降低較多的牛黃體分泌的孕酮少。低體況分總是與卵巢活性延遲，垂體激素釋放不明顯，卵泡對促性腺激素的反應低及卵泡活力下降相聯(lián)系。奶牛產(chǎn)后出現(xiàn)乏情是正常的生理調(diào)節(jié)，但當它延長到繁殖期時，就會導致繁殖障礙[12]。盡管增加日糧能量可改善能量平衡與繁殖力之間的關系，但其作用方式尚不明了。并且體況不能直接的反映產(chǎn)后乏情奶牛代謝和生殖機能異常的信息，難以為現(xiàn)場早期預防乏情提供更科學的、有效的策略；（3）內(nèi)分泌異常：在維持代謝與生殖機能之間存在著許多起連接作用的物質(zhì)，包括內(nèi)分泌系統(tǒng)復雜的綜合作用以及控制新陳代謝和生殖機能的代謝信號和激素等。這些信號分子都屬于調(diào)節(jié)能量和營養(yǎng)物質(zhì)分配及生殖機能的控制系統(tǒng)。當營養(yǎng)物在體內(nèi)被識別后許多位點、器官，會產(chǎn)生這些信號分子。為了確保能量調(diào)節(jié)，蛋白質(zhì)分配，繁殖過程中的綜合作用的精確進行，任何一種信號都很可能會與其他信號存在相互作用。前視覺-下丘腦連續(xù)體涉及食物、發(fā)情行為、營養(yǎng)感覺的綜合作用，可以釋放激素。這些激素可以控制促性腺激素和生長激素的分泌，促性腺系統(tǒng)是在繁殖中起關鍵作用，而生長激素系統(tǒng)在泌乳、脂解作用、組織維持中起關鍵作用[15]。另外，促性腺激素、生長激素與其他的激素如類胰島素生長因子（IGF）、胰島素等相互作用，促進激素和代謝物的釋放，這些激素能回流到控制食欲和繁殖的中樞。它們也會直接作用于乳腺和生殖器官。另外，卵泡的敏感性與外周的代謝激素濃度變化是協(xié)同的。這些代謝激素包括生長激素、胰島素、IGF-1和生物堿，可影響體內(nèi)脂肪酸、氨基酸、葡萄糖等代謝物的變化[16]。相關研究表明，在反芻動物中某些代謝激素能直接地明顯地調(diào)節(jié)卵巢中雌二醇的分泌。卵巢對刺激生殖腺的作用有一定程度的獨立性，并能對代謝物做出直接的反應[11]。這些都會受到奶牛產(chǎn)后營養(yǎng)和代謝物質(zhì)及泌乳量等多種因素的影響，導致內(nèi)分泌失調(diào)，造成奶牛乏情。由于參與奶牛產(chǎn)后發(fā)情調(diào)控的因子眾多、途徑復雜，因此明確奶牛發(fā)情和乏情之間體內(nèi)能量代謝和生殖機能的主要差異變化，對闡明奶牛產(chǎn)后乏情的能量代謝調(diào)控作用機制具有重要的理論意義。

1.2 奶牛乏情的檢測方法 在奶牛養(yǎng)殖中，為增加牛奶產(chǎn)量，使奶牛及時受孕、產(chǎn)犢并提高泌乳是非常重要的，而要達到上述目的，正確高效地預測以及檢測奶牛的發(fā)情，并適時配種尤為關鍵。傳統(tǒng)的奶牛發(fā)情行為檢測方法包括：外部觀察法，試情法，直腸檢查法和B超檢查[17]。以上各種方法都具有一個共同點，那就是都需要大量的勞動力來實際操作，并且會影響到奶牛的正?；顒?，效率低，且要求管理人員技術嫻熟，工作量大，勞動強度大，負擔較重，且準確度較低，因而時常錯過奶牛的發(fā)情期而不能及時配種。因此，傳統(tǒng)的奶牛發(fā)情檢測方法愈加不能滿足現(xiàn)代化奶牛養(yǎng)殖場的需求，基于微機系統(tǒng)的自動化電子檢測技術開始應用到奶牛發(fā)情檢測。這些技術主要是傳感器技術包括角度傳感器、計步器、加速度傳感器、自動圖像處理技術、激光技術、位置控制技術以及磁場感應技術等，結(jié)合專家分析平臺。數(shù)字化檢測儀器不僅大大減少了勞動負擔，對奶牛的繁殖性能測定比傳統(tǒng)方法更精確，大大提高奶牛繁殖效率[18-19]。然而，這些數(shù)字化檢測系統(tǒng)僅能檢測奶牛發(fā)情行為和某些生理指標（心跳、脈搏和體溫等），甚至孕酮等，能及時發(fā)現(xiàn)發(fā)情和乏情奶牛，卻無法獲知乏情奶牛體內(nèi)代謝和生殖機能異常的變化，查明奶牛乏情的真正病因，為奶牛乏情提供有效的防治策略。究其原因是至今缺乏可用于監(jiān)測奶牛產(chǎn)后乏情的有效的、實用的特征性生物標示物，這已成為當前高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后繁殖障礙亟需解決的關鍵問題之一。

2 蛋白質(zhì)組學的研究現(xiàn)狀

2.1 蛋白質(zhì)組學（Proteomics）的研究內(nèi)容 1994年，澳大利亞Wilkins等首先提出了蛋白質(zhì)組學的概念[20]。蛋白質(zhì)組學指由一個基因組或一個細胞、組織表達的所有蛋白質(zhì)。它是對應于一個基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，而不是局限于一個或幾個蛋白質(zhì)。由于同一基因組在不同細胞、不同組織的表達情況各不相同，即使是同一細胞，在不同的發(fā)育階段和不同的生理條件甚至不同的環(huán)境影響下，其蛋白質(zhì)的存在狀態(tài)也不盡相同。因此，蛋白質(zhì)組學是一個在空間和時間上動態(tài)變化著的整體[21]。蛋白質(zhì)組學研究的主要內(nèi)容包括蛋白質(zhì)的表達模式和蛋白質(zhì)的功能模式兩個方面。蛋白質(zhì)表達模式的研究是蛋白質(zhì)組學研究的基礎內(nèi)容，主要研究特定條件下某一細胞或組織的所有蛋白質(zhì)的表征問題[22]。蛋白質(zhì)組學研究主要有3方面內(nèi)容：（1）功能蛋白質(zhì)組學：對某個體系的蛋白質(zhì)組進行鑒定并詳細闡述其翻譯后修飾的特性及其功能；（2）差異蛋白質(zhì)組學，即比較蛋白質(zhì)組學：以重要生命過程或重大疾病為對象，比較細胞或機體在生理和病理過程中的蛋白質(zhì)表達變化；（3）相互作用蛋白質(zhì)組學：通過多種先進技術研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，繪制某個體系的蛋白質(zhì)間相互作用和聯(lián)系的網(wǎng)絡圖譜[23]。

2.2 蛋白質(zhì)組學的主要研究技術 蛋白質(zhì)組學的研究技術一般分為樣品制備技術、蛋白質(zhì)分離技術、蛋白質(zhì)定量分析技術、蛋白質(zhì)鑒定技術、蛋白質(zhì)之間的相互作用技術和生物信息學分析[24]。蛋白質(zhì)分離技術包括雙向凝膠電泳（two-dimensionaldifferential gelelectrophoresis，2-DE）、高效液相色譜技術（high performance liquid chromatography，HPLC）和毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）。蛋白質(zhì)鑒定技術主要是質(zhì)譜（mass spectrometry，MS），傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學技術一般是應用熒光雙向差異凝膠電泳（fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis，2D-DIGE）與基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術（matrix associated laserdesorption ionization time of flightmass spectrometry，MALDI-TOF-MS）相結(jié)合的方法分離和鑒定蛋白質(zhì)的。隨著蛋白質(zhì)組學的研究技術平臺的發(fā)展，同位素標記蛋白質(zhì)相對和絕對定量分析（Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ）技術、表面增強激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜（surface-enhanced laser desorption/ionization time of flightmass spectrometry，SELDI-TOFMS）和電噴霧質(zhì)譜技術也憑借其操作簡單和樣品選擇范圍廣等優(yōu)勢被越來越多的應用[25]。

2.3 蛋白質(zhì)組學的應用 蛋白質(zhì)組學的研究雖起步較晚，但進展迅速。越來越多對動物方面的研究也應用蛋白質(zhì)組學的思維方向，以及蛋白質(zhì)組學的技術平臺，對其動物研究方向進行分子水平的研究。蛋白組學可用于監(jiān)測疾病發(fā)生的機制。Kerstin N Euler等人[26]利用2-DE結(jié)合MS技術研究牛新生兒全血細胞減少癥，檢測到幾個與凝血相關和免疫調(diào)節(jié)的蛋白，縮小了引起其發(fā)生的蛋白質(zhì)的范圍，為該病免疫機制的研究奠定了基礎。Zhou D H等人[27]利用2-DE結(jié)合MALDI-TOF/TOF技術發(fā)現(xiàn)了鼠腦部早期形成弓形蟲囊蚴時腦部蛋白的變化，尋找出了60個差異表達蛋白，顯示了弓形蟲囊蚴蛋白和正常腦部蛋白的差異，闡明了弓形蟲腦炎的發(fā)病機制。舒適等人[25]應用2D-DIGE/MALDI-TOF-MS技術分離和鑒定了13種差異表達蛋白，應用生物信息學技術探究了這些差異蛋白與疾病可能存在的關系，闡明奶牛乳熱發(fā)生機制和判定病情與防治效果提供了新的方向。蛋白質(zhì)組學技術還可以用來尋找疾病早期的蛋白標記物，為疾病的早期診斷提供依據(jù)。George J等人[28]利用2-DE結(jié)合MS尋找到哺乳動物溴氰菊酯中毒引起的潛在的皮膚腫瘤早期的蛋白標記物，為腫瘤發(fā)生的早期診斷提供了依據(jù)。

3 蛋白質(zhì)組學在奶牛產(chǎn)后乏情研究中的應用

為了更好的理解奶牛產(chǎn)后乏情的機制以及其預防，需要從以下3個方面進行研究：分娩前后疾病對繁殖的影響；影響排卵的基因；在代謝信號和內(nèi)分泌軸及生殖器官之間起重要連接作用的蛋白的影響[29]。S.Z.El-Zarkouny[30]等人研究了乏情奶牛的血清代謝物和激素的變化，檢測了多種生化指標和激素，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)后不發(fā)情與低鉀、低體況評分和血清尿素氮升高密切相關。R.J.Hawken[31]等也研究了與肉牛生殖系統(tǒng)有關的基因，發(fā)現(xiàn)SNP（single nucleotide polymorphisms）與牛的生殖系統(tǒng)密切相關。但有關能量負平衡引起蛋白改變從而使代謝信號改變的相關研究尚未涉及。

大量文獻證實，能量代謝障礙不僅是酮病、脂肪肝、糖尿病等奶牛主要代謝病的主要危險因素，而且與機體其他各系統(tǒng)如生殖系統(tǒng)許多重要疾病如乏情、胎衣不下、子宮內(nèi)膜炎等有密切關系，已成為奶牛圍產(chǎn)期健康的主要威脅之一。雖經(jīng)長期的探索，因能量負平衡所致的奶牛產(chǎn)后乏情發(fā)病機理仍不十分清楚，但現(xiàn)已公認它是由多基因、多因素導致的一類復雜性生理異常過程[32]。因此，需要從不同角度、不同層次進行系統(tǒng)、深入研究并通過綜合分析才能對其有一個較為全面的了解。隨著功能基因組學、蛋白質(zhì)組學理論和研究技術的興起和發(fā)展，我們可以利用蛋白質(zhì)組學技術研究與能量負平衡密切相關的奶牛產(chǎn)后乏情，以尋找特異性生物標志物群及其代謝過程為目標，深入探討和全面了解其發(fā)生、發(fā)展機制和生理、病理狀態(tài)，為疾病診斷和發(fā)現(xiàn)更有效的綜合治療方法提供理論和實驗依據(jù)。

4 展望

近10年來，蛋白質(zhì)組學技術的迅速發(fā)展，給研究者提供了全景式、全面系統(tǒng)的方法揭示疾病發(fā)生發(fā)展的平臺，為探究更多的、新的生物標識物提供了方法學基礎。集成蛋白質(zhì)組學多項技術深入系統(tǒng)的探討泌乳早期能量負平衡對奶牛乏情的調(diào)控作用機制，對豐富和發(fā)展奶牛發(fā)情期能量調(diào)控作用具有重要的理論和現(xiàn)實意義，為奶牛乏情的早期診斷提供理論依據(jù)。相信未來我們會運用這些科學技術解決奶牛乏情這一養(yǎng)殖業(yè)重要問題，從而更有效的提高奶牛繁殖效率，進而促進奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

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