楊昕霆 閻海霞 沈珝琲 張 業(yè)

奧德賽(Odyssey)近紅外雙熒光掃描系統(tǒng)是近年來引進(jìn)的一種新技術(shù)。近紅外雙熒光掃描系統(tǒng)的工作原理是使用激光激發(fā)帶有特殊標(biāo)記的抗體或者熒光染料，受激發(fā)的抗體或染料釋放出近紅外熒光，樣品發(fā)射出的700nm和800nm近紅外熒光信號(hào)可以被掃描儀器接收，并且計(jì)量近紅外熒光值，從而完成蛋白質(zhì)的定性或定量測(cè)量。這種測(cè)量方式可以精確測(cè)定局部的蛋白質(zhì)含量，并且可以通過計(jì)算總熒光量完成定性定量實(shí)驗(yàn)。

KDM3A是JHDM2去甲基化酶家族中最早發(fā)現(xiàn)的成員，能夠去除組蛋白 H3K9的單甲基和雙甲基［1］。研究表明，KDM3A能夠影響精子的發(fā)生，參與脂肪代謝及多種癌癥的發(fā)生過程［2～4］。

近紅外雙熒光掃描系統(tǒng)可以完成多種蛋白質(zhì)定性定量實(shí)驗(yàn)，尤其是在ICW(in cell western)中有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)初步證明了KDM3A能夠發(fā)生去磷酸化修飾，并且利用奧德賽近紅外雙熒光掃描系統(tǒng)初步篩選到4種PP1與PP2磷酸酯酶家族中可能參與蛋白KDM3A去磷酸化過程的磷酸酯酶亞基。

材料與方法

1．主要材料與試劑:磷酸化KDM3A抗體于MBL公司訂購(gòu)。DRAQ5細(xì)胞核染料為Cell Signalling Technology產(chǎn)品。近紅外雙色熒光Phospho-EGFR Tyr104為L(zhǎng)I-COR產(chǎn)品。轉(zhuǎn)染試劑Vigofect為威格拉斯生物技術(shù)公司產(chǎn)品。岡崎酸OA為Sigma公司產(chǎn)品。磷酸酯酶RNAi干擾文庫(kù)由哈佛醫(yī)學(xué)院Martin E．Dorf教授惠贈(zèng)。

2．細(xì)胞系:HEK293T細(xì)胞系為本課題組保留。

3．細(xì)胞培養(yǎng):用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4．細(xì)胞轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染24h前接種HEK293T細(xì)胞，細(xì)胞匯合度達(dá)60%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)Vigofect轉(zhuǎn)染試劑說明書將磷酸酯酶干擾質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染6h后更換新鮮培養(yǎng)液，36～48h后收取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

5．細(xì)胞免疫熒光:賴氨酸包被蓋玻片10min，PBS沖洗3次，紫外照射1h。接種細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)60% ～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6h后，更換含有一定濃度OA的新鮮DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。36h后，用含4%多聚甲醛的PBS緩沖液固定細(xì)胞10min，PBS漂洗3次;用0．2%Triton X-100透化細(xì)胞15min，PBS漂洗3次。加入含1%BSA的PBS緩沖液37℃靜置30min，封閉非特異性抗原表位。封閉結(jié)束后，將相應(yīng)的特異性抗體按照一定稀釋比例加入緩沖液中，于4℃雜交過夜。孵育結(jié)束后用PBS洗3次。加入帶有熒光標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，PBS洗 3次。DAPI工作液染細(xì)胞核5min，PBS沖洗后封片，用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

6．細(xì)胞近紅外雙熒光掃描:將HEK293T細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)60% ～80%時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)24h后用含4%多聚甲醛的PBS緩沖液固定細(xì)胞10min，PBS漂洗3次;使用0．2%Triton X-100透化細(xì)胞15min，PBS漂洗3次。Odyssey封閉液室溫處理細(xì)胞30min，封閉非特異性抗原。封閉結(jié)束后，加入磷酸化KDM3A的抗體4℃雜交過夜;用含0．1%Tween-20的PBS緩沖液漂洗3次。加入近紅外熒光二抗Phospho-EGFR Tyr1045室溫孵育1h;PBS緩沖液漂洗3次。用近紅外熒光染料DRAQ5染細(xì)胞核5min，PBS漂洗后使用近紅外熒光掃描儀進(jìn)行掃描分析。

結(jié) 果

1．免疫熒光驗(yàn)證KDM3A去磷酸化過程:岡崎酸OA(Okazaki acid)是磷酸酯酶PP1和PP2的廣譜抑制劑，不同濃度的OA可以抑制不同家族磷酸酯酶的活性［5，6］。免疫熒光結(jié)果表明未經(jīng)OA處理的對(duì)照組HEK293T細(xì)胞中僅有極微弱的熒光信號(hào);高濃度(15nmol/L)OA處理的實(shí)驗(yàn)組HEK293T細(xì)胞中出現(xiàn)明顯增強(qiáng)的熒光信號(hào)(圖1)。本實(shí)驗(yàn)初步證明在HEK293T細(xì)胞中存在KDM3A的去磷酸化過程。

圖1 岡崎酸OA(15nmol/L)處理后HEK293T細(xì)胞中存在KDM3A的去磷酸化過程(免疫熒光，×100)

2．抗體濃度優(yōu)化:將磷酸化KDM3A的一抗及二抗按照不同比例進(jìn)行稀釋。不同稀釋比例的抗體雜交后進(jìn)行近紅外雙熒光掃描。將掃描所得數(shù)值繪制成柱形圖(圖2)。結(jié)果表明，抗體濃度過高時(shí)，掃描值會(huì)溢出;抗體濃度過低時(shí)，檢測(cè)靈敏度下降，背景值過高。后續(xù)實(shí)驗(yàn)按照磷酸化KDM3A一抗 1∶400，二抗 Phospho-EGFR Tyr1045 1∶800 的稀釋比例進(jìn)行。

圖2 抗體濃度優(yōu)化

3．利用磷酸酯酶RNAi干擾文庫(kù)篩選KDM3A的去磷酸化磷酸酯酶:將PP1和PP2磷酸酯酶家族蛋白的RNAi干擾文庫(kù)(共357個(gè)干擾質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞，OA處理24h后進(jìn)行ICW實(shí)驗(yàn)，每個(gè)干擾質(zhì)粒設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。通過近紅外雙熒光系統(tǒng)進(jìn)行掃描(圖3)，將OA處理的實(shí)驗(yàn)組與未處理的對(duì)照組熒光比值進(jìn)行對(duì)比，分析發(fā)現(xiàn)其中4種磷酸酯酶亞基(表1)的熒光強(qiáng)度比值較高，推測(cè)這幾種磷酸酯酶亞基在KDM3A去磷酸化過程中可能起到關(guān)鍵作用。

圖3 岡崎酸處理轉(zhuǎn)染磷酸酯酶RNAi干擾文庫(kù)的HEK293T細(xì)胞遠(yuǎn)紅外雙熒光掃描圖

討 論

去甲基化酶KDM3A最早是在減數(shù)分裂和減數(shù)分裂后期雄性精子的cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的，是一種H3K9單甲基化和雙甲基化的去甲基化酶［7］。越來越多的研究表明，KDM3A不僅在激素誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著重要作用，還參與生物體發(fā)育與疾病等多種重要的生理病理過程［8，9］。KDM3A能夠通過調(diào)控HOXA1基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期［10］。KDM3A的缺失會(huì)導(dǎo)致精子細(xì)胞染色質(zhì)凝聚過程異常，最終造成雄性小鼠不育［11］。KDM3A能夠去除干性基因Tcl1、Tcfcp211和Zfp57等基因啟動(dòng)子的H3K9二甲基化，從而維持細(xì)胞的干性［12］。

表1 可能參與KDM3A去磷酸化過程的磷酸酯酶亞基

本課題組以往工作發(fā)現(xiàn)在Jurkat細(xì)胞的熱應(yīng)激反應(yīng)中KDM3A會(huì)發(fā)生特異位點(diǎn)的磷酸化，該位點(diǎn)磷酸化后KDM3A能夠特異結(jié)合到某些免疫相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)，激活與熱應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)。雖然KDM3A的磷酸化通路已經(jīng)找到(待發(fā)表)，但其去磷酸化的過程及機(jī)制尚不明確。

實(shí)驗(yàn)首先通過磷酸酯酶抑制劑OA處理HEK293T細(xì)胞，初步證明PP1和PP2磷酸酯酶家族蛋白可能參與KDM3A去磷酸化過程。近紅外雙熒光掃描系統(tǒng)是最近幾年的新技術(shù)，它能夠利用激光激發(fā)近紅外熒光信號(hào)，并且通過捕獲這些信號(hào)對(duì)細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。近紅外雙熒光掃描系統(tǒng)可以快速的對(duì)高通量的目標(biāo)蛋白進(jìn)行定性與定量的分析，筆者利用近紅外雙熒光掃描系統(tǒng)初步篩選出4種可能參與KDM3A去磷酸化過程的磷酸酯酶亞基，進(jìn)一步的鑒定需要更多的實(shí)驗(yàn)手段與方法來實(shí)現(xiàn)。KDM3A在精子的發(fā)生、脂肪代謝及多種癌癥的發(fā)生過程中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，研究KDM3A的磷酸化與去磷酸化修飾過程與機(jī)制將對(duì)多種疾病的治療提供新的線索與靶點(diǎn)。

1 Klose RJ，Kallin EM，Zhang Y．JmjC-domain-containing proteins and histone demethylation［J］．Nat Rev Genet，2006，7(9):715-727

2 Okada Y．Histone demethylase JHDM2A is critical for Tnp1 and Prm1 transcription and spermatogenesis［J］．Nature，2007，450(7166):119-123

3 Okada Y，Tateishi K，Zhang Y．Histone demethylase JHDM2A is involved in male infertility and obesity［J］．J Androl，2010，31(1):75-78

4 Krieg AJ．Regulation of the histone demethylase JMJD1A by hypoxiainducible factor 1 alpha enhances hypoxic gene expression and tumor growth［J］．Mol Cell Biol，2010，30(1):344-353

5 Goris J．Okadaic acid，a specific protein phosphatase inhibitor，induces maturation and MPF formation in Xenopus laevis oocytes［J］．FEBS Lett，1989，245(1-2):91-94

6 Franchini A，Malagoli D，Ottaviani E．Targets and effects of yessotoxin，okadaic acid and palytoxin:a differential review［J］．Mar Drugs，2010，8(3):658-677

7 Yamane K．JHDM2A，a JmjC-containing H3K9 demethylase，facilitates transcription activation by androgen receptor［J］．Cell，2006，125(3):483-495

8 Yamada D．Role of the hypoxia-related gene，JMJD1A，in hepatocellular carcinoma:clinical impact on recurrence after hepatic resection［J］．Ann Surg Oncol，2012，19 Suppl 3:S355-364

9 Pedersen MT，Helin K．Histone demethylases in development and disease［J］．Trends Cell Biol，2010，20(11):662-671

10 Cho HS．The JmjC domain-containing histone demethylase KDM3A is a positive regulator of the G1/S transition in cancer cells via transcriptional regulation of the HOXA1 gene［J］．Int J Cancer，2012，131(3):E179-189

11 Inagaki T．Obesity and metabolic syndrome in histone demethylase JHDM2a-deficient mice［J］．Genes Cells，2009，14(8):991-1001

12 Ma DK．G9a and Jhdm2a regulate embryonic stem cell fusion-induced reprogramming of adult neural stem cells［J］．Stem Cells，2008，26(8):2131-2141