李 橋，劉傳通，潘乙懷

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，浙江溫州 325027)

串珠素在大鼠牙髓損傷修復(fù)過程中表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)研究

李 橋，劉傳通，潘乙懷

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，浙江溫州 325027)

目的:探討串珠素在牙髓損傷修復(fù)過程中的表達(dá)變化及其可能的作用。方法:取雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為4組(n=12)。建立大鼠一側(cè)上頜第一磨牙牙髓損傷模型，另一側(cè)同名牙作為正常對照組;分別于損傷后1、3、5、7d各取1組目標(biāo)牙樣本，采用免疫組化染色和Real－time PCR觀察檢測各組牙髓組織中串珠素的表達(dá)變化，并采用單因素方差分析比較各組間的差異。結(jié)果:免疫組化染色顯示，牙髓損傷后，牙髓組織中串珠素染色強(qiáng)度增加，各實(shí)驗(yàn)組的平均光密度均明顯高于正常對照組(P＜0.05)，并以1d組升高最為明顯;RT－PCR檢測顯示，與正常對照組相比，串珠素mRNA的相對表達(dá)量在牙髓損傷后1d明顯下降，此后隨時(shí)間延長逐漸回升，損傷后7d時(shí)回升最明顯，但仍明顯低于對照組(P＜0.05)。結(jié)論:串珠素在牙髓組織損傷后的防御機(jī)制中起一定的作用，但其表達(dá)的增加并不是由其生物合成增加所致。

串珠素;免疫組化;大鼠;牙髓損傷

［牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2014，24(1):17］

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2014，24(1):17］

牙源性的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在牙髓組織損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著重要功能，具有抑菌作用［1］、促礦化作用［2］，并能影響牙髓細(xì)胞的遷移［3］而參與牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體的修復(fù)和再生過程。串珠素(perlecan)是一種廣泛存在于ECM中的蛋白質(zhì)，在調(diào)節(jié)多種組織的損傷修復(fù)中均具有重要作用［4］;但其在牙髓損傷修復(fù)過程中的表達(dá)及作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從蛋白和基因水平觀察串珠素在大鼠牙髓組織損傷前后的表達(dá)變化，探討串珠素在牙髓損傷修復(fù)過程中的可能的作用。

1 材料和方法

1.1 牙髓損傷動物模型的制備

取體質(zhì)量180～220g雄性SD大鼠 (溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)48只，以100g/L水合氯醛腹腔注射(3 mL/kg體質(zhì)量)麻醉后，仰臥固定，常規(guī)口內(nèi)外消毒。然后用牙科高速渦輪機(jī)配以G1球鉆分別在每只大鼠的一側(cè)上頜第一磨牙牙合面?zhèn)涠?，?dāng)出現(xiàn)一小的穿髓點(diǎn)時(shí)立即停止，生理鹽水充分沖洗，無菌棉球輕壓止血，保持窩洞開放狀態(tài)下常規(guī)飼養(yǎng)。每只大鼠的另一側(cè)上頜同名牙不做任何處理，用于正常對照。

1.2 分組和取材

將建模后的48只大鼠隨機(jī)分為4組(每組12只);分別于建模后1、3、5、7d各取1組大鼠，其中6只用40g/L多聚甲醛液心內(nèi)灌注處死后分離雙側(cè)上頜骨。然后將各組頜骨標(biāo)本浸泡于新配制的40g/L多聚甲醛溶液內(nèi)固定48 h;100g/L EDTA溶液中脫鈣4周;常規(guī)脫水、置換、石蠟包埋，沿牙體長軸作近遠(yuǎn)中向連續(xù)切片(片厚4 μm)，用于免疫組化染色。

各組另外6只大鼠分別于麻醉后直接分離上頜雙側(cè)第一磨牙，置于液氮中冷凍保存，用于PCR檢測。

1.3 免疫組化染色觀察各組牙髓中串珠素的表達(dá)

1.3.1 免疫組化染色及結(jié)果判定

選取各組通過穿髓孔的切片，常規(guī)脫蠟至水，并按照免疫組化試劑盒說明進(jìn)行免疫組化染色，鏡下觀察。以細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜或細(xì)胞外間質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色染色者為陽性結(jié)果，其中淺黃色為弱陽性表達(dá);棕黃色為陽性表達(dá);棕褐色為強(qiáng)陽性表達(dá)。

1.3.2 平均光密度分析

各組每個(gè)標(biāo)本選取3張切片，高倍鏡視野下(×200)下選取牙髓未腐敗壞死部分，在相同拍攝條件下運(yùn)用顯微圖像系統(tǒng)拍攝圖片，并用Image－Pro Plus 5.0圖像分析軟件計(jì)算每個(gè)視野陽性表達(dá)的平均光密度值(average opticaldensity，AOD)。計(jì)算公式為:平均光密度值=所選視野陽性表達(dá)的積分光密度值(integral opticaldensity，IOD)/所選視野的總面積。

1.4 各組牙髓中串珠素mRN表達(dá)水平的檢測

取液氮冷凍的各組雙側(cè)上頜第一磨牙，低溫下劈開并取出牙髓組織，按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA;經(jīng)OD260/280值檢測確定其純度和完整性良好后，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDMA。然后以cDNA 為模板，β－actin為內(nèi)參照，在 Real－timeRCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系20 μL，分別為:cDNA 2 μL、上下游引物各 1 μL、雙蒸水 6 μL、SYBRgreen Mix 10 μL。擴(kuò)增條件:95℃變性5 s;60℃退火20 s，72℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。最后根據(jù)各樣本目的基因和內(nèi)參基因的反應(yīng)CT值，采用2－ΔΔCT法計(jì)算各樣品串珠素mRNA的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所用引物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成，具體序列見表1。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果

正常對照組中，串珠素在成牙本質(zhì)細(xì)胞層呈陰性表達(dá);在牙髓組織的多細(xì)胞層以及固有牙髓、前期牙本質(zhì)中呈彌散性弱陽性表達(dá)(圖1a)。牙髓損傷后1d組中，串珠素在穿髓孔附近炎癥細(xì)胞浸潤區(qū)及其下方的牙髓組織中呈陽性表達(dá)(圖1b)。3d組和5d組中，串珠素在炎癥細(xì)胞浸潤區(qū)呈散在強(qiáng)陽性表達(dá)，其下方牙髓組織中呈弱陽性表達(dá)，(圖1c、d)。7d組中，串珠素在炎細(xì)胞浸潤區(qū)與壞死組織交界處的纖維組織中呈陽性表達(dá);炎細(xì)胞浸潤區(qū)以及根髓中呈弱陽性表達(dá)(圖1e)。PBS代替一抗的空白對照組均未見陽性表達(dá)。

光密度分析顯示，牙髓損傷后1～7d各實(shí)驗(yàn)組中串珠素染色陽性區(qū)的平均光密度值均明顯高于正常對照組(P＜0.05);各實(shí)驗(yàn)中以損傷1d組的光密度值最高，此后隨著損傷時(shí)間延長逐漸下降;各實(shí)驗(yàn)組兩兩相比，除1d與7d組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)外，其余各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)(表2)。

表2 各組串珠素染色陽性光密度值比較(±s)

表2 各組串珠素染色陽性光密度值比較(±s)

組別AOD正常對照組 0.0770 ±0.0157a損傷1d 0.2638 ±0.0750b損傷3d 0.2312 ±0.0567bc損傷5d 0.1859 ±0.0669bc損傷7d 0.1571 ±0.0217c

圖1 串珠素在大鼠損傷牙髓中的表達(dá)(SP，×200)

2.2 Real－time PCR 檢測結(jié)果

RT－PCR檢測顯示，牙髓損傷1～7d不同時(shí)間后，各實(shí)驗(yàn)組牙髓組織中串珠素mRNA相對表達(dá)均明顯低于正常對照組(P＜0.05)，其中以損傷1d組下降最明顯，此后隨著時(shí)間延長，串珠素mRNA表達(dá)水平逐漸回升，7d時(shí)回升最明顯;各實(shí)驗(yàn)組間兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表3)。

表3 各組串珠素mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

目前已知，串珠素可以存儲多種生長因子，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和基質(zhì)合成，保持細(xì)胞外基質(zhì)平衡等作用，并參與多種組織的損傷修復(fù)過程和炎癥發(fā)生發(fā)展過程［4］;而且這些作用在腦組織損傷［5－6］、動脈粥樣硬化［7－8］等的發(fā)生、發(fā)展中均已得到證實(shí)。本結(jié)果顯示，正常大鼠牙髓組織中串珠素呈彌散性弱陽性表達(dá)，與國外學(xué)者在小鼠發(fā)育中的研究結(jié)果相一致［9］。牙髓損傷后串珠素表達(dá)增強(qiáng)，并分布于炎癥進(jìn)展的前沿，與炎癥細(xì)胞浸潤呈一定的相關(guān)性;提示串珠素在牙髓損傷后的防御機(jī)制和炎癥細(xì)胞浸潤中起重要的作用。

有研究表明，串珠素可被分泌進(jìn)入細(xì)胞間隙，并介導(dǎo)信號分子的活動［10］。串珠素基因敲除的小鼠在胚胎發(fā)育過程中表現(xiàn)出一系列復(fù)雜的異常表型，造成循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)異常和骨骼、軟骨缺陷及死胎［11－12］，這可能是由于其信號傳導(dǎo)通路受干擾所致;提示串珠素基因的完整和正確表達(dá)是維持機(jī)體生長發(fā)育及正常生理功能所必需的。此外，串珠素基因的異常表達(dá)還可造成小鼠牙體硬組織形態(tài)發(fā)生異常［9－13］，因而，可以認(rèn)為串珠素基因的正確表達(dá)是組織結(jié)構(gòu)重建的重要因素。

本實(shí)驗(yàn)通過 Real－time PCR檢測了串珠素mRNA在大鼠上頜第一磨牙牙髓損傷不同時(shí)間后的表達(dá)變化，結(jié)果顯示:串珠素mRNA表達(dá)水平的變化與免疫組化結(jié)果相反，在損傷初期明顯下降;提示牙髓損傷后串珠素表達(dá)增加的機(jī)制可能并不是由mRNA水平調(diào)節(jié)造成的，推測可能存在其他更加重要的調(diào)節(jié)方式。Jung等［14］發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，如在皮膚紫外線損傷急性期，串珠素mRNA的表達(dá)下調(diào)，但其蛋白水平上升。這種相反表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚，推測其原因可能有以下3個(gè)方面:①分解串珠素的酶下調(diào)所致，諸如heparanase、組織蛋白酶和BMP1/Tolloid－like蛋白酶等若下調(diào)，則可減少串珠素的酶解，從而導(dǎo)致串珠素蛋白的表達(dá)相對增加;②由機(jī)體其他部位運(yùn)輸而來，如造血細(xì)胞來源的肥大細(xì)胞在組織損傷時(shí)向受損部位遷移，并能分泌串珠素，調(diào)節(jié)損傷部位的血管生成作用和基質(zhì)的代謝［15］;③正常狀態(tài)下，部分串珠素在細(xì)胞外基質(zhì)中與其他細(xì)胞外成分結(jié)合，封閉了其抗原位點(diǎn)，而當(dāng)組織損傷時(shí)，由于細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞，則可釋放出包含抗原位點(diǎn)的串珠素，從而使其表達(dá)相對增多。當(dāng)然，也可能還存在其他一些尚未認(rèn)識到的機(jī)制，需進(jìn)一步深入研究。

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Experimental study of perlecan expression in ratdental pulp after injury

LI Qiao，LIU Chuan－tong，PAN Yi－h(huán)uai
(Hospital of Stomatology，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325027，China)

AIM:To investigate perlecan expression indental pulp of rats after injury.METHODS:Dental pulp injury models were established in maxillary first molars on one side of 48 SD rats，the isonym healthy teeth on the opposite side were used as the controls.1，3，5 and 7days after injury perlecan expression of thedental pulp was examined by immunohistochemistry and real－time PCR(n=12).Data were statistically analyzed by ANOVA.RESULTS:The average opticaldensity(AOD)of staining intensity of perlecan in the injureddental pulps was higher than that in the controls at all time points(F=9.511，P ＜0.05)，1d after injury AOD of the injurygroup was the highest(P ＜0.05).The relative expression of perlecan mRNA(perlecan/β－ actin)wasdecreased in the injurygroups(F=198.152，P ＜0.05)1d after pulp injury，andgradually increased in the followingdays，but lower than that in the controls(P ＜0.05).CONCLUSION:Perlecan may play an important role in tissuedefense mechanism afterdental pulp injury.

perlecan;immunohistochemistry;rat;dental pulp injury

R780.2

A

1005－2593(2014)01－0017－04

2013－07－10

浙江省教育廳科研計(jì)劃項(xiàng)目(20051196)溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(Y20100015)

李橋(1983－)，男，漢族，浙江溫州人。碩士，住院醫(yī)師

潘乙懷，E－mail:773502228@qq.com