隋 麗 陳 冬 張慧云 何韶衡 (遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，錦州 121001)

IL-29對胰蛋白酶誘導的肥大細胞PARs表達的調(diào)節(jié)作用①

隋 麗 陳 冬 張慧云②何韶衡③(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，錦州 121001)

目的:檢測白細胞介素29(Interleukin-29，IL-29)對胰蛋白酶引起的肥大細胞蛋白酶激活受體(Protease activated receptor，PAR)-1，2，3，4表達的調(diào)節(jié)作用。方法:P815肥大細胞培養(yǎng)后，用不同濃度的IL-29、胰蛋白酶單獨或聯(lián)合激發(fā)肥大細胞，在不同時間點收集激發(fā)細胞，用流式細胞術(shù)(FCM)及實時定量PCR檢測P815肥大細胞蛋白酶激活受體的表達。結(jié)果:IL-29單獨作用能夠下調(diào)肥大細胞PAR-1蛋白及mRNA水平的表達，上調(diào)PAR-3、PAR-4 mRNA的表達，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);以IL-29預處理肥大細胞后，IL-29對胰蛋白酶誘導的肥大細胞PAR-2、PAR-3、PAR-4表達起促進作用，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)論:IL-29能夠調(diào)節(jié)胰蛋白酶引起的肥大細胞PARs表達，從而參與肥大細胞相關的炎癥反應。

肥大細胞;白細胞介素29(IL-29);胰蛋白酶;蛋白酶激活受體(PARs);流式細胞術(shù)

隨著過敏性疾病呈明顯上升趨勢，近幾年有關過敏反應領域的研究也進展迅速，而肥大細胞脫顆粒反應被認為是過敏性炎癥過程中主要細胞反應之一，其作為初級效應細胞參與過敏性疾病的發(fā)病機制，肥大細胞一旦被過敏原激活后即釋放細胞內(nèi)預先形成的及新合成的介質(zhì)而發(fā)揮其生物學作用，但其確切機制仍需進一步探討。

IL-29是近年發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子，又稱為干擾素 λ1(Interferon λ1，IFNλ1)，主要在上皮細胞及肝細胞中表達，不同起源的造血和非造血細胞被各種病毒感染后，可誘導表達IL-29，新近的研究發(fā)現(xiàn)大部分人的肥大細胞表達IL-29，并且蛋白水解性變應原能刺激肥大細胞釋放大量的IL-29，在過敏性哮喘患者外周血漿中存在高水平的IL-29[1-4]，因此，血漿中高水平的IL-29很可能來源于肥大細胞，而肥大細胞是參與過敏反應的核心細胞，IL-29可能是過敏反應中的重要促炎性細胞因子。蛋白酶激活受體(Protease activated receptors，PARs)是G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors，GPCRs)家族中的新成員，目前在人和小鼠體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)4種PARs的存在，即 PAR-1、2、3、4，胰蛋白酶作為 PARs激活酶，通過PARs相關機制誘導人肥大細胞組胺釋放[5]，在過敏性炎癥中發(fā)揮重要作用。因此我們擬通過流式細胞術(shù)及實時定量PCR研究IL-29對胰蛋白酶引起的肥大細胞PARs表達的調(diào)節(jié)，期待為與肥大細胞相關的過敏性疾病的發(fā)病機制相關研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 青鏈霉素、多聚甲醛、牛血清白蛋白均購于Sigma公司，含25 mmol/L羥乙基哌嗪乙磺酸的培養(yǎng)基、達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基、胎牛血清購于Gibco公司，重組人 IL-29、小鼠抗人IL-29單克隆抗體購于美國R＆D公司，胰蛋白酶(Trypsin)購于Promega公司，F(xiàn)ITC標記的兔抗鼠PAR-1單克隆抗體、羊抗鼠 PAR-2單克隆抗體、兔抗鼠PAR-3多克隆抗體、兔抗鼠PAR-4多克隆抗體購于Santa Cruz公司。PCR引物由Invitrogen公司合成，Trizol試劑購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑及試劑盒由TaKaRa公司提供。

1.1.2 主要儀器 臺式高速冷凍離心機購于Expender公司，細胞培養(yǎng)箱購于Heraeus公司，生物安全柜HFsafe1200購于Heal Force公司，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀購于Becton Dickinson公司。紫外分光光度計及電泳儀購于Bio-Rad公司，PCR擴增儀購于M J Research公司，凝膠成像分析系統(tǒng)購自SYNGENE公司，型熒光定量PCR擴增儀購于ABI-PE公司。

1.1.3 細胞株 小鼠肥大細胞株P815購于美國標準培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、激發(fā) 肥大細胞的培養(yǎng)按參考文獻[6]進行。1.2×106個/ml的 P815肥大細胞采用無血清基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后，PBS洗滌細胞2次，分別用 IL-29(0.1、1、10、100 ng/ml)及 trypsin (0.001、0.01、0.1、1 μg/ml)單獨或聯(lián)合處理 P815肥大細胞，于2、6、16 h后終止反應，于4℃條件下450 r/min離心10 min，收集并用PBS重懸細胞后，待流式細胞術(shù)(FCM)及實時定量PCR分析。

1.2.2 肥大細胞 PAR-1、2、3、4表達的檢測 上述激發(fā)后的肥大細胞經(jīng)20 g/L的多聚甲醛固定30 min后，用含10 g/L牛血清白蛋白的PBS洗滌、重懸細胞。PAR-1、PAR-3及PAR-4的標記:加兔抗鼠PAR-1單克隆抗體或兔抗鼠PAR-3、PAR-4多克隆抗體及同型對照2 mg/L，37℃孵育1 h后，用含10 g/L牛血清白蛋白的PBS洗滌2次后加入FITC標記的羊抗兔多克隆抗體1 mg/L，37℃孵育 1 h。PAR-2的標記:加FITC標記的羊抗鼠PAR-2單克隆抗體以及同型對照4 mg/L，37℃孵育1 h后，用含10 g/L牛血清白蛋白的PBS洗滌2次，PBS重懸細胞，與相應的二抗孵育后，以FCM檢測肥大細胞PARs的表達情況。

1.2.3 實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(q-RTPCR) 激發(fā)后的P815肥大細胞實時定量PCR按參考文獻[7]進行。PARs及β-actin內(nèi)參引物序列詳見表1。

1.3 統(tǒng)計學處理 全部數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0軟件分析，數(shù)據(jù)均以±s表示。統(tǒng)計學方法為單因素方差分析或t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-29對肥大細胞PARs蛋白表達的調(diào)節(jié)作用濃度為0.1、1、10、100 ng/ml的 IL-29 單獨作用于肥大細胞2、6、16 h后，F(xiàn)CM結(jié)果顯示:肥大細胞PAR-1平均熒光強度下降幅度分別達39%、45%、31%，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，PAR-2、PAR-3、PAR-4平均熒光強度與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義;應用1.0 μg/ml的IL-29單克隆抗體封閉 IL-29 后，PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4平均熒光強度與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，圖 1)。

2.2 IL-29對肥大細胞PARs mRNA的調(diào)節(jié)作用濃度為0.1、1、10、100 ng/ml的 IL-29 單獨作用于肥大細胞2、6、16 h后，實時定量PCR結(jié)果顯示:IL-29呈濃度依賴性下調(diào)肥大細胞PAR-1 mRNA的表達，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，在作用16 h時下調(diào)強度最大達79.4%;IL-29對肥大細胞PAR-2 mRNA的表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);IL-29對肥大細胞 PAR-3、PAR-4 mRNA的表達起促進作用，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，在6 h及16 h時作用最強，分別達9.5 倍，11.2 倍(圖2)。

表1 實時定量PCR的引物序列Tab.1 Primer sequences for mouse PARs used in real time PCR

2.3 IL-29對胰蛋白酶引起的肥大細胞PARs蛋白表達的調(diào)節(jié) 用0.1 ng/ml的IL-29預處理肥大60 min 后，用 0.001、0.01、0.1 和 1 μg/ml的胰蛋白酶激發(fā)細胞16 h，F(xiàn)CM檢測結(jié)果顯示:IL-29對胰蛋白酶引起的肥大細胞PAR-1平均熒光強度表達與基礎培養(yǎng)液對照組、單純IL-29作用組、單純trypsin作用組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，PAR-2、PAR-3、PAR-4 平均熒光強度分別增強 2.1、1.6、1.8倍，與基礎培養(yǎng)液對照組、單純IL-29作用組、單純trypsin作用組相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，IL-29對胰蛋白酶作用的肥大細胞表面PARs表達的促進作用與胰蛋白酶的濃度無關(圖3)。

圖1 IL-29 對 P815 肥大細胞 PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4蛋白表達的調(diào)節(jié)作用Fig.1 Effect of IL-29 on expression of protease activated receptor(PAR)-1，PAR-2，PAR-3，PAR-4 protein on P815 cells

圖2 IL-29 對 P815 肥大細胞 PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4 mRNA表達的調(diào)節(jié)作用Fig.2 Effect of IL-29 on expression of protease activated receptor(PAR)-1，PAR-2，PAR-3，PAR-4 mRNAs on P815 cells

圖3 IL-29對胰蛋白酶引起的肥大細胞PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4表達的調(diào)節(jié)作用Fig.3 Effect of IL-29 on trypsin-induced expression of protease activated receptor PAR-1，PAR-2，PAR-3 and PAR-4 on P815 cells

3 討論

PARs為絲氨酸蛋白酶受體，目前共發(fā)現(xiàn)4種PARs的存在，即 PAR-1、2、3、4。其中 PAR-1 是胰蛋白酶和凝血酶受體[8]，本研究發(fā)現(xiàn)IL-29單獨作用時能夠下調(diào)肥大細胞PAR-1蛋白及mRNA的表達，而胰蛋白酶和凝血酶已經(jīng)被證實積極參與炎癥過程[9-10]，由此可以推測IL-29也可能通過下調(diào)肥大細胞PAR-1表達來參與和調(diào)節(jié)炎癥反應過程，相關的其他細胞因子對PAR-1表達的調(diào)節(jié)作用的研究發(fā)現(xiàn)[11]支持本研究結(jié)果;PAR-2是胰蛋白酶、類胰蛋白酶和彈性蛋白酶受體，PAR-3和PAR-4是凝血酶受體[8，12]，PAR-2 已經(jīng)證實在過敏性疾病中具有正性調(diào)節(jié)作用，例如PAR-2在哮喘及過敏性鼻炎患者氣道的表達增強[13，14]，PAR-2 能夠促進德國小鐮過敏患者的呼吸道中Th2及Th17類細胞因子的釋放等[15]，在本實驗發(fā)現(xiàn) IL-29對肥大細胞 PAR-2、PAR-3、PAR-4蛋白的表達幾乎均沒有作用，但在mRNA水平，能夠增強肥大細胞PAR-3、PAR-4的表達，IL-29 對肥大細胞 PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4表達調(diào)節(jié)作用的不同可能與細胞內(nèi)池募集不同類型PARs的動員及釋放情況不同有關[16]，此外，也可能與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制的改變有關[17]。

本研究中發(fā)現(xiàn)IL-29對胰蛋白酶引起的肥大細胞PAR-1表達幾乎沒有作用，對 PAR-2、PAR-3、PAR-4表達起促進作用，說明胰蛋白酶對IL-29引起的PAR-1下調(diào)有抑制作用，同時與IL-29協(xié)同誘導PAR-2、PAR-3、PAR-4蛋白的表達，這可能提示肥大細胞活化過程中存在一種放大機制:IL-29存在于未激活的肥大細胞中[3]，過敏原能夠誘導肥大細胞聚集和激活，激活后的肥大細胞能夠分泌胰蛋白酶和IL-29，分泌的IL-29不但募集肥大細胞向炎癥部位聚集，還能夠使鄰近的肥大細胞在胰蛋白酶的作用下表達更多的PARs，而肥大細胞PARs的過量表達使之更容易與蛋白酶作用，從而導致肥大細胞活化。IL-29通過激活肥大細胞內(nèi)PI3K/Akt和JAK/ STAT3信號轉(zhuǎn)導通路，誘導肥大細胞釋放Th2類細胞因子如IL-4、IL-13等，這些Th2細胞因子進一步作用于其他炎癥細胞而使過敏性炎癥反應放大[18]。CD18及細胞間黏附分子-1可能參與IL-29誘導的肥大細胞募集[3]，但因肥大細胞黏附及遷移機制并不清楚，IL-29對肥大細胞募集作用的確切機制還需進一步研究。之前的研究發(fā)現(xiàn)低濃度的趨化因子CCL5能夠增強胰蛋白酶誘導的肥大細胞PAR-1、PAR-2和PAR-4表達，類胰蛋白酶誘導的PAR-2的表達和凝血酶誘導的PAR-1和PAR-4也支持上述觀點[19]。肥大細胞產(chǎn)生的細胞因子具有增敏作用，如IL-29對肥大細胞PARs表達的調(diào)節(jié)并且促進胰蛋白酶引起的肥大細胞釋放促炎細胞因子，這些都有助于過敏性炎癥的發(fā)展。而IL-29對胰蛋白酶作用的肥大細胞PARs表達的促進作用與胰蛋白酶濃度無關，這可能與胰蛋白酶的含量達到閾值有關。

綜上，IL-29能夠選擇性地下調(diào)肥大細胞PAR-1蛋白及mRNA水平的表達，增強PAR-3、PAR-4 mRNA水平的表達，也能夠通過促進胰蛋白酶引起肥大細胞PAR-2、PAR-3、PAR-4表達參與過敏性炎癥反應，但多種理化刺激、病理過程能調(diào)節(jié)PARs的表達情況[20]，且轉(zhuǎn)錄翻譯、膜表面轉(zhuǎn)運和溶酶體降解都與PARs表達的調(diào)節(jié)密切相關，所以仍期待深入探究各種因素包括IL-29對胰蛋白酶引起的肥大細胞PARs表達調(diào)節(jié)的確切機制。

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[收稿2013-12-07 修回2014-01-13]
(編輯 張曉舟)

Effect of IL-29 on trypsin-induced protease-activated receptor expression on P815 mast cells

SUI Li，CHEN Dong，ZHANG Hui-Yun，HE Shao-Heng.Department of ENT，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China

Objective:To investigate the modulatory effect of IL-29 on trypsin-induced protease activated receptors(PARs)expression on P815 mast cell.MethodsAfter P815 mast cells were challenged with different concentrations of IL-29 alone or combined with trypsin for 2 h，6 h and 16 h，the challenged cells were collected and analysed by flow cytometry to detect the protein expression of PARs on P815 cells，and analysed by real time RT-PCR to detect the mRNA expression of PARs on P815 cells.ResultsCompared with the corresponding control，IL-29 induced significantly decreased expression of PAR-1 at protein and mRNA level on P815 cells，and upregulated PAR-3，PAR-4 mRNA level on P815 cells，whereas IL-29 did little effect on the expressions of PAR-2，3，4 at protein level on P815 cells accordingly.Preincubation of mast cell with IL-29 did not alter trypsin-induced PAR-1 expression on P815 cells，whereas up-regulated expression of PAR-2，3，4 were detected when P815 cell were pre-treated with IL-29 before being challenged with trypsin compared with the corresponding control.ConclusionIL-29 can upregulate trypsin-induced PARs expression on mast cells through which participated in mast cell related inflammation.

Mast cell;Interleukin-29(IL-29);Trypsin;Protease activated receptors(PARs);Flow cytometry

R329.8

A

1000-484X(2014)05-0609-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.008

①本文為 國 家 自 然 科 學基 金 (81241135，81060250，81172836，

81030054)和遼寧省博士科研啟動基金資助項目(20101063)。②海南醫(yī)學院病理生理學教研室，?？?71101。

③遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院變態(tài)反應與臨床免疫研究中心，錦州121001。

隋 麗(1981年-)，女，主要從事過敏性鼻炎發(fā)病機制的研究，E-mail:suili1018@163.com。

及指導教師:陳 冬(1972年-)，男，博士，主任醫(yī)師，教授，碩士生導師，主要從事過敏性鼻炎發(fā)病機制的研究，E-mail:entdoctorchen@163.com。