黃月紅 陳運(yùn)新 張莉娟 陳治新 王小眾 (福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科，福州350001)

rIL-10基因干預(yù)對肝纖維化大鼠肝組織中膠原、MMP13及TIMP1表達(dá)的影響①

黃月紅 陳運(yùn)新 張莉娟 陳治新 王小眾②(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科，福州350001)

目的:觀察膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶13(Matrix metalloproteinase 13，MMP13)及其抑制物基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1(Tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1)在豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織中的表達(dá)及大鼠白介素10(rat interleukin-10，rIL-10)基因干預(yù)的影響，探討rIL-10基因抗肝纖維化的作用機(jī)制。方法:30只清潔級SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組(C組)和纖維化模型組。C組每周腹腔注射2次生理鹽水，每次0.5 ml，共8周;纖維化模型組每周腹腔注射2次豬血清，每次0.5 ml，共8周。至造模第5周開始模型組隨機(jī)分為纖維化組(M組)，rIL-10基因干預(yù)組(I組)及空質(zhì)粒對照組(P組)。C組和M組大鼠尾靜脈注射林格氏液作為試劑對照，I組大鼠尾靜脈注射rIL-10質(zhì)粒pcDNA3-rIL-10，P組大鼠尾靜脈注射pcDNA3空質(zhì)粒，每周1次。于第8周末處死所有大鼠。天狼猩紅染色檢測各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織膠原沉積情況，S-P免疫組化檢測各組大鼠肝臟MMP13及TIMP1表達(dá)的情況。結(jié)果:天狼猩紅染色顯示:與C組比較，豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化模型M組及空質(zhì)粒對照P組大鼠肝組織中膠原沉積面積顯著增多(P＜0.01);與M組和P組比較，rIL-10基因干預(yù)I組大鼠肝組織中膠原的沉積面積顯著減少(P＜0.01);免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:與C組比較，豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化模型M組及空質(zhì)粒對照P組大鼠肝組織中MMP13及TIMP1表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，I組纖維化大鼠肝組織中MMP13表達(dá)上調(diào)而TIMP1表達(dá)顯著減少(P＜0.01)，與M組和P組比較，I組纖維化大鼠肝組織中MMP13及TIMP1表達(dá)顯著減少(P＜0.01)。結(jié)論:rIL-10基因抑制肝纖維化大鼠肝臟膠原沉積與其抑制基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物TIMP1的表達(dá)相關(guān)。

肝纖維化;大鼠白介素10;基因治療;基質(zhì)金屬蛋白酶-13;基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1

肝纖維化是肝臟對各種慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)，其本質(zhì)是肝組織合成增加和(或)降解減少所致各種膠原及非膠原糖蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)過度沉積，是肝硬化的早期病理改變。肝硬化是消化系統(tǒng)常見病，其嚴(yán)重的并發(fā)癥及高病死率是臨床治療的難點(diǎn)。目前研究認(rèn)為肝纖維化是一個(gè)動態(tài)、雙向的過程，阻止或延長肝纖維化的形成是肝硬化研究的熱點(diǎn)。白介素10(Interleukin 10，IL-10)是一類具有多種生物學(xué)活性的免疫抑制性細(xì)胞因子，前期研究表明外源性細(xì)胞因子IL-10具有一定的拮抗肝纖維化形成的特性[1]，但其具體的作用機(jī)制仍未闡明。本實(shí)驗(yàn)擬通過豬血清誘導(dǎo)免疫型大鼠肝纖維化并行rIL-10基因干預(yù)，觀察rIL-10基因干預(yù)對肝纖維化大鼠肝組織中膠原沉積、基質(zhì)金屬蛋白酶-13(Matrix metalloproteinase 13，MMP13)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1(Tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1)表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討rIL-10抗肝纖維化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 大鼠 雄性清潔級 SD大鼠30只，體重200～300 g，中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號SCXK(滬)2003-0003]，清潔級條件喂養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水。動物實(shí)驗(yàn)遵照福建醫(yī)科大學(xué)倫理委員會實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例執(zhí)行，并接受倫理委員會的監(jiān)督和指導(dǎo)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 pcDNA3-rIL-10真核表達(dá)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建;pcDNA3空質(zhì)粒本實(shí)驗(yàn)室保存;Qiagen Maxi-Prep質(zhì)粒大抽提試劑盒購自美國Qiagen公司、豬血清購自芬蘭PAA細(xì)胞培養(yǎng)公司、超敏二步法免疫組化檢測試劑及濃縮型DAB顯色液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;大鼠MMP13及TIMP1單克隆抗體購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的提取 通過堿裂解法原理提取pcDNA3空質(zhì)粒與pcDNA3-rIL-10真核表達(dá)質(zhì)粒，操作步驟嚴(yán)格按Qiagen質(zhì)粒大抽提試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 質(zhì)粒DNA尾靜脈快速大容量注射[2]rIL-10基因通過質(zhì)粒DNA尾靜脈快速大容量注射靶向轉(zhuǎn)移至大鼠的肝組織[3]。清潔級雄性SD大鼠在10%水合氯醛(0.3 ml/100 g體重)麻醉下，24G靜脈套管針尾靜脈注射大鼠體重8%林格氏溶液(內(nèi)含pcDNA3-rIL-10真核表達(dá)質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒)，rIL-10基因濃度為1 μg/g體重，注射時(shí)間控制在10 s以內(nèi)。

1.2.3 大鼠肝纖維化模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 造模及實(shí)驗(yàn)分組:30只體重100～120 g、清潔級、雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為正常對照組(C組，6只)和纖維化模型組(24只)。肝纖維化模型組大鼠腹腔內(nèi)注射豬血清，正常對照組大鼠腹腔注射生理鹽水每周2次，每次0.5 ml，共8周。至肝纖維化造模第5周，模型組被隨機(jī)分為纖維化組(M組，8只)，rIL-10基因干預(yù)組(I組，8只)，空質(zhì)粒對照組(P組，8只)。C組和M組大鼠尾靜脈注射林格氏液作為試劑對照，I組大鼠尾靜脈注射pcDNA3-rIL-10質(zhì)粒，P組大鼠尾靜脈注射 pcDNA3空質(zhì)粒，每周1次，共4周。

1.2.4 肝組織標(biāo)本收集 于第8周末處死所有實(shí)驗(yàn)大鼠，收集各組大鼠肝組織。用10%甲醛固定后石蠟包埋、切片以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 天狼猩紅染色法檢測肝組織中膠原表達(dá)

各組大鼠肝組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，入天青石藍(lán)液10 min，蒸餾水洗3次，苦味酸天狼猩紅染色30 min，純酒精分化2 s，脫水、透明，中性樹膠封片。膠原纖維表達(dá)的圖像分析:BX-41奧林巴斯顯微呈像系統(tǒng)，對陽性染色區(qū)域進(jìn)行圖像半定量分析。每張切片隨機(jī)選5個(gè)不同視野，以5個(gè)不同視野面積百分比的平均值為每張切片半定量數(shù)值。

1.2.6 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠肝組織MMP13與TIMP1的表達(dá) 采用超敏S-P免疫組織化學(xué)染色，具體操作按北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司SP試劑盒說明進(jìn)行。切片脫蠟、水化，枸櫞酸鹽微波或胰蛋白酶抗原修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，一抗分別為，兔抗大鼠MMP-13多抗(1∶100)，兔抗大鼠TIMP-1多抗(1∶200)，二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。省略一抗和二抗作為空白對照;以PBS替換一抗，作為陰性對照。陽性染色者在細(xì)胞漿或/和核或/和膜有棕黃色顆粒沉著。染色結(jié)果根據(jù)染色細(xì)胞多少及染色深淺判斷各指標(biāo)表達(dá)情況，使用Im-age-pro plus 5.0軟件檢測各組目的蛋白表達(dá)綜合光密度(IOD)。

2 結(jié)果

2.1 rIL-10基因干預(yù)減少纖維化大鼠肝臟組織中膠原的沉積[3]天狼猩紅染色是判斷肝組織膠原沉積的經(jīng)典方法[4]。肝組織中膠原組織呈紅色，非膠原組織呈黃色。染色結(jié)果顯示(圖1A):C組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，中央靜脈壁周圍及肝竇周圍有少量膠原纖維著色，M組大鼠肝臟組織中可見大量膠原沉積，形成纖維間隔并向肝組織穿插形成大小不等的假小葉;P組大鼠膠原沉積的情況與M組相似。I組肝組織膠原沉積明顯減少，無纖維間隔。通過圖像半定量分析結(jié)果顯示(圖1B):與C組比較，M組、P組膠原纖維含量顯著增高(P＜0.01);與M組和P組比較，I組膠原纖維含量顯著下降(P＜0.01);P組與M組之間膠原纖維沉積沒有顯著的改變(P ＞0.05)。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組肝組織膠原纖維沉積情況(天狼猩紅染色，×200)Fig.1 Deposition of collagen in liver of different groups (Sirius Red staing，×200)

圖2 各實(shí)驗(yàn)組肝組織MMP13的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色，×200)Fig.2 Expression of MMP13 in liver of different groups (Immunohistochemistry staining，×200)

圖3 各實(shí)驗(yàn)組肝組織TIMP1的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色，×200)Fig.3 Expression of TIMP1 in liver of different groups(Immunohistochemistry staining，×200)

2.2 rIL-10基因干預(yù)抑制纖維化大鼠肝臟組織MMP-13的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示(圖2A): MMP-13棕黃色陽性著色主要位于肝細(xì)胞及竇周細(xì)胞的胞漿。MMP-13蛋白陽性表達(dá)半定量分析結(jié)果顯示(圖2B)，與C組比較，M組、P組及I組的大鼠肝組織中MMP13表達(dá)明顯增強(qiáng)，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，與M組和P組比較，I組纖維化大鼠肝組織中MMP13表達(dá)顯著減少，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

2.3 rIL-10基因干預(yù)抑制纖維化大鼠肝臟組織中TIMP-1的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示:TIMP-1棕黃色陽性著色主要位于肝竇周圍細(xì)胞及膠原纖維沉積的部位(圖3A)。TIMP-1陽性表達(dá)半定量分析結(jié)果顯示(圖3B)，與C組比較，P組與M組大鼠的肝組織中TIMP-1表達(dá)明顯增強(qiáng)，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，I組大鼠的肝組織TIMP-1陽性著色顯著降低，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與P組與M組比較，I組大鼠的肝組織TIMP-1陽性著色范圍及程度均顯著降低，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

肝纖維化主要病理改變是以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的合成與降解失平衡，是各種損傷導(dǎo)致的慢性肝臟疾病的共同病理改變，是肝硬化的早期病理改變。肝纖維化時(shí)肝組織內(nèi)ECM的降解主要依賴一類具有Ca2+-Zn2+離子依賴的內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)及其抑制因子基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因 子 (Tissue inhibitorofmetalloproteinases，TIMPs)的調(diào)節(jié)。因此任何提高M(jìn)MPs、降低TIMPs的表達(dá)與活性，促進(jìn)ECM降解的方法都有可能成為抗肝纖維化的有效手段。

IL-10是一類主要Th2細(xì)胞產(chǎn)生的具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子[5]，研究顯示IL-10與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。研究發(fā)現(xiàn)在肝纖維化早期肝星狀細(xì)胞(HSC)表達(dá)IL-10，而在肝纖維化后期IL-10表達(dá)下降至消失，及IL-10基因缺陷的小鼠較野生型小鼠更易形成肝纖維化等研究結(jié)果提示肝纖維化時(shí)肝臟內(nèi)IL-10的表達(dá)缺失與肝纖維化的進(jìn)展密切相關(guān)[7，8]。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)外源性 IL-10可拮抗CCL4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的作用及肝臟靶向表達(dá)rIL-10基因能拮抗豬血清誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的形成[1，3，9]。豬血清誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化是一種由異種血清引起的免疫性肝纖維化動物模型，其特點(diǎn)是肝細(xì)胞損傷較輕而免疫反應(yīng)強(qiáng)烈。此種免疫反應(yīng)是由MHCⅡ類分子及炎性細(xì)胞調(diào)節(jié)，活化肝星狀細(xì)胞，活化的肝星狀細(xì)胞分泌 ECM形成肝纖維化[10，11]。本實(shí)驗(yàn)天狼猩紅染色結(jié)果顯示豬血清造模結(jié)束時(shí)肝纖維化大鼠肝組織中可見大量以膠原為主的ECM沉積，形成寬大的纖維束向肝組織穿插形成大小不等的假小葉。行rIL-10基因干預(yù)4周后，纖維化大鼠肝組織中ECM明顯減少，僅見少量、不連續(xù)的、細(xì)薄的膠原纖維沉積。提示rIL-10基因干預(yù)能減少ECM的沉積，具有拮抗肝纖維化形成的作用，但其抗纖維化機(jī)制是否通過改變 MMPs與TIMPs的表達(dá)有關(guān)，仍不清楚。

目前已發(fā)現(xiàn)的MMPs主要分為四大類:①膠原酶，MMP1、MMP8、MMP13，主要是降解Ⅰ、Ⅲ型間質(zhì)膠原，但MMP13是大鼠體內(nèi)主要降解Ⅰ、Ⅲ型膠原的間質(zhì)膠原酶。②明膠酶，MMP2和MMP9，主要降解Ⅳ型膠原及變性膠原，在纖維化形成早期起主要作用。③基質(zhì)分解素，如MMP3、MMP7等主要降解蛋白多糖，層粘蛋白等。④膜型MMPs，有MMP14、MMP15等即可降解膠原也能激活其他 MMPs[12]。TIMPs主要與特定的活性膠原酶MMPs通過非共價(jià)鍵結(jié)合成1∶1復(fù)合物，抑制后者對ECM的降解。多項(xiàng)研究表明上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP13及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物TIMP1的表達(dá)可增加ECM的降解從而減輕大鼠肝纖維化[13，14]。但 rIL-10 基因抑制纖維化大鼠肝組織中膠原的沉積是否與MMP13和TIMP1的表達(dá)相關(guān)呢?國內(nèi)外研究顯示MMP13的表達(dá)在不同的肝纖維化模型大鼠中表達(dá)不盡相同，Yan等[15]用RT-PCR法連續(xù)觀察了酒精誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化形成過程MMP13的表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肝纖維化形成早期(第4周)MMP13表達(dá)開始上調(diào)，12周時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰，24周后表達(dá)下降，提示MMP13主要參與了大鼠肝纖維化的早期新形成基質(zhì)的降解;而在膽汁淤積性纖維化大鼠中MMP13表達(dá)下調(diào)[14]。前期研究證實(shí)TIMP1隨著肝臟纖維程度增強(qiáng)表達(dá)水平逐漸升高[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示豬血清誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝組織中肝實(shí)質(zhì)與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞均可見MMP13陽性表達(dá)，提示肝纖維化時(shí)大量的膠原沉積反饋激活肝實(shí)質(zhì)與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞表達(dá)MMP13增高加強(qiáng)沉積膠原的降解作用;而TIMP1陽性表達(dá)主要見于膠原沉積的部位，提示TIMP1的表達(dá)部位與膠原沉積部位密切相關(guān)，與肝纖維化時(shí)活化的肝星狀細(xì)胞是肝組織中TIMP1的主要來源細(xì)胞[17]結(jié)果相符。半定量結(jié)果顯示肝纖維化大鼠MMP13與TIMP1的陽性表達(dá)較正常對照組大鼠明顯增多，推測肝纖維化形成時(shí)高表達(dá)的TIMP1明顯可能抑制了MMP13的活性，從而減弱其降解膠原的能力導(dǎo)致ECM沉積增多。但rIL-10基因干預(yù)后以膠原沉積為主的ECM沉積減少是否是通過增強(qiáng)MMP13及抑制TIMP1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的呢?免疫組化結(jié)果顯示rIL-10基因干預(yù)四周后的肝纖維化大鼠伴隨著膠原沉積面積的下降MMP13與TIMP1的表達(dá)也明顯下調(diào)，提示rIL-10基因干預(yù)能下調(diào)MMP13與TIMP1的表達(dá)。但rIL-10基因干預(yù)后纖維化大鼠肝組織中MMP13和TIMP1下降程度是不同的，大鼠肝組織中TIMP1下降程度較MMP13明顯，提示rIL-10基因干預(yù)減輕肝組織膠原沉積可能主要通過抑制肝組織中TIMP1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)，但具體機(jī)制仍有待體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，MMP13與TIMP1在豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織表達(dá)情況與膠原沉積面積密切相關(guān)，rIL-10基因干預(yù)可通過抑制TIMP1的表達(dá)從而促進(jìn)沉積膠原的降解。

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[收稿2013-11-20 修回2013-12-26]

(編輯 倪 鵬)

Effects of rat interleukin-10 gene treatment on expression of collagen，MMP13 and TIMP1 in fibrotic rats

HUANG Yue-Hong，CHEN Yun-Xin，ZHANG Li-Juan，CHEN Zhi-Xin，WANG Xiao-Zhong.Department of Gastroenterology，F(xiàn)ujian Medical University Union Hospital，F(xiàn)uzhou 350001，China

Objective:To study the effects of rat interleukin-10(rIL-10)gene treatment on the expression of collagen，matrix metalloproteinase 13(MMP13)and their specific inhibitors the tissue inhibitor of metalloproteinase 1(TIMP1)in porcine serum induced liver fibrosis rats then to explore the anti-fibrotic effect of rL-10.MethodsThirty SD rats were divided into normal control and fibrosis model group.Normal control group(group C)was intraperitoneally injected with 0.5 ml normal sodium twice a week for 8 week，while the fibrosis model group was injected with equal volume of pig serum for 8 week.At the beginning of the 5thweek，fibrosis model group was further randomly divided into a fibrosis model subgroup(group M)，rIL-10 gene treatment subgroup(group I)and empty vector control subgroup(group P).Rats in group C and M were injected with Ringer’s solution as a reagent control via the tail vein weekly，rats in group I were injected with the rIL-10 plasmid pcDNA3-rIL-10，and rats in group P were injected with empty vector pcDNA3.All rats were sacrificed at the end of 8thweek，and the liver tissue samples were collected to observe deposition of collegan in liver tissue by sirius red staining and detected the expression of MMP13 and TIMP1 in the liver tissue by SP immunohistochemistry.ResultsSirius red staining showed that the area of the collegan deposition was dramatically increased in fibrosis model subgroup and empty vector control subgroup compared with the normal control group，and the area of the collagen deposition was dramatically decreased in rIL-10 gene treatment subgroup compared with the fibrosis model and empty vector control subgroup.Immunohistochemistry analysis showed that the expression of MMP13 and TIMP1 in fibrosis model subgroup and empty vector control subgroup was significantly higher than the normal control group，but compared with normal control group，expression of MMP13 was significantly increased and expres-sion of TIMP1 was significantly decreased in rIL-10 gene treatment subgroup.Compared with fibrosis model subgroup and empty vector control subgroup，the expression of MMP13 and TIMP1 was dramatically decreased in rIL-10 gene treatment subgroup.ConclusionrIL-10 gene treatment attenuates the area of collagen deposition in liver fibrosis rats associated with downregulation of TIMP1.

Liver fibrosis;Rat interleukin 10;Gene therapy;Matrix metalloproteinase 13;Tissue inhibitor of metalloproteinase 1

Q786 R392.11

A

1000-484X(2014)05-0613-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.009

①本文為福建省科自然基金資助項(xiàng)目(2010J05062)、福建衛(wèi)生廳青年科研項(xiàng)目(2010-1-10)和福建省臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)專科資助項(xiàng)目(閩衛(wèi)科教[2012]149號)。

②通訊作者，E-mail:drwangxz@163.com。

黃月紅(1976年－)，女，博士，副主任檢驗(yàn)師，主要從事肝纖維化分子發(fā)生機(jī)制及IL-10的抗纖維研究，E-mail:2003huangyh@ sina.com。