李 強(qiáng) 王志豪 金秀芳 徐永平 郭 曉 陳文東 董 偉 （西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌 712100）

γ-干擾素受體在雌性山羊星狀神經(jīng)節(jié)的表達(dá)①

李 強(qiáng) 王志豪 金秀芳 徐永平 郭 曉 陳文東 董 偉 （西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌 712100）

目的:為了解雌性山羊星狀神經(jīng)節(jié)是否具備接受γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）作用的條件，即是否有IFN-γ受體（Interferon-γreceptor，IFNGR）存在。方法:取雌性山羊星狀神經(jīng)節(jié)，用免疫組化SP法和PCR方法檢測IFNGR在星狀神經(jīng)節(jié)的表達(dá)情況。結(jié)果:結(jié)果顯示，在雌性山羊星狀的神經(jīng)元、支持細(xì)胞和神經(jīng)纖維均有IFNGR免疫陽性產(chǎn)物分布，但主要分布于神經(jīng)元細(xì)胞膜與細(xì)胞核，IFNGR在神經(jīng)元胞體的相對表達(dá)量極顯著高于非神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)（P＜0.01）。在山羊星狀神經(jīng)節(jié)擴(kuò)增到IFNGR1基因的cDNA片段全長376 bp，山羊IFNGR1基因與綿羊基因同源性最高（98%），其次為牛（97%）。結(jié)論:在雌性山羊星狀神經(jīng)節(jié)中IFNGR主要在交感節(jié)后神經(jīng)元表達(dá)與分布，具備對IFN-γ刺激做出反應(yīng)的條件，提示雌性山羊星狀神經(jīng)節(jié)可能作為IFN-γ對心血管免疫調(diào)節(jié)途徑和自主神經(jīng)對心血管調(diào)節(jié)的神經(jīng)途徑之間相互協(xié)調(diào)的關(guān)鍵點(diǎn)。

γ-干擾素受體;星狀神經(jīng)節(jié);免疫組織化學(xué)SP法;PCR;山羊

IFN-γ是一種糖蛋白，主要是由抗原、有絲分裂素等刺激、活化的CD4+Th1、CD8+T細(xì)胞及NK細(xì)胞所分泌?？乖細(xì)胞促分裂素（PHA、ConA）、細(xì)胞因子 （IL-2、IL-12、IL-18、bFGF、PDGF、EGF）、葡萄球菌腸毒素B均會誘導(dǎo)IFN-γ的合成。其他細(xì)胞類型如神經(jīng)元［1］、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞（DC）和 γ/δT細(xì)胞在特定的條件下也能夠表達(dá)IFN-γ。IFN-γ具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ在免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)均有分布［2］。IFN-γ的生物活性依賴于靶細(xì)胞膜上的受體而發(fā)揮。IFNGR為IFNGR1和IFNGR2組成的二聚體［3-5］。IFN-γ 與受體結(jié)合可 以激活JAK1、JAK2和STAT1，進(jìn)而誘導(dǎo)在啟動子區(qū)域包含γ-激活序列（GAS）的基因的表達(dá)［5-7］。Eid 等研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ對血管平滑肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)起促進(jìn)作用［8］。研究還發(fā)現(xiàn)IFN-γ不僅能抑制平滑肌細(xì)胞增殖，還可通過激活細(xì)胞表面的 Fas配體從而誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的凋亡［9］。IFN-γ能通過激活單核細(xì)胞，降解膠原蛋白和彈力蛋白，使得動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定而破裂，起到緩解脈粥樣硬化的作用［10］。上述研究提示IFN-γ可以作用于心血管系統(tǒng)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

星狀神經(jīng)節(jié)（又稱頸胸神經(jīng)節(jié)）由頸下交感節(jié)（頸后神經(jīng)節(jié)）和第一胸交感節(jié)融合而成，支配很多組織器官如心臟、血管、汗腺等，其中發(fā)出心神經(jīng)是支配心臟的交感節(jié)后神經(jīng)纖維主要來源之一［11-13］。研究發(fā)現(xiàn)，單側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)阻滯后左心室收縮和舒張功能均減弱，并且刺激單側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)時，左心室的收縮功能和舒張功能也發(fā)生變化［14，15］。綜上所述，IFN-γ可以直接作用于心血管而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。星狀神經(jīng)節(jié)也可對心血管起自主神經(jīng)調(diào)節(jié)作用。那么支配心血管自主神經(jīng)纖維主要來源的星狀神經(jīng)節(jié)對心血管的調(diào)節(jié)與IFN-γ對心血管的調(diào)節(jié)之間是如何協(xié)調(diào)的呢?本試驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)SP法和分子生物學(xué)方法檢測IFNGR在星狀神經(jīng)節(jié)上的表達(dá)及分布情況，旨在證明星狀神經(jīng)節(jié)上是否具備接受IFN-γ作用的條件，為進(jìn)一步探討IFN-γ與星狀神經(jīng)節(jié)對心血管的調(diào)節(jié)之間的關(guān)系提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 形態(tài)學(xué)檢測

1.1.1 試驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動物:成年健康的空懷雌性關(guān)中奶山羊5只。

1.1.2 石蠟切片的制備及其染色 將成年健康的空懷雌性山羊保定、麻醉，動脈放血處死后，迅速取出星狀神經(jīng)節(jié)，星狀神經(jīng)節(jié)經(jīng)40 g/L的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定4 h后，用自來水沖洗10 h，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后，做6μm厚的切片。切片分4套，其中一套用于HE染色，用作組織定位對照;第二套切片脫蠟、復(fù)水，經(jīng)抗原熱修復(fù)之后，進(jìn)行免疫組化SP法染色。按照免疫組化SP超敏試劑盒（邁新，福州）說明書程序操作，A、B、C、D 液依次分別15、15、20、20 min，在 B 液之后加 1∶200 稀釋（稀釋液，北京鼎國昌盛）的兔抗IFNGR多克隆抗體（博士德，武漢），4℃過夜，復(fù)溫后依次加C液、D液之后，DAB（華美生物，武漢）顯色，以上每步之后經(jīng)PBS充分洗滌。常規(guī)脫水、透明、中性樹脂封片。第三套SP法染色后用蘇木精復(fù)染，用于IFNGR陽性細(xì)胞分布特點(diǎn)觀察。第四套做陰性對照，用PBS替代兔抗IFNGR抗體做空白對照，其余步驟與第三套相似。Motic生物顯微鏡下觀察，拍照，并記錄結(jié)果。

1.1.3 圖像分析 光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄切片，Motic數(shù)碼顯微鏡下拍照，測量數(shù)據(jù)。每只山羊分別選取連續(xù)5張切片，每張片子隨機(jī)選取5個視野，用高清晰圖像分析系統(tǒng)（江蘇捷達(dá)）進(jìn)行分析，計算出每種細(xì)胞的相對表達(dá)量（相對表達(dá)量=光鏡倍數(shù)×陽性面積×平均光密度/像素）。將圖像相對表達(dá)量數(shù)據(jù)用SPSS18.0軟件分析，表達(dá)量的平均值用x-±s表示，用單因子方差分析（One-way ANOVA，LSD）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，差異顯著P＜0.05，差異極顯著P＜0.01。

1.2 IFNGR1 mRNA在星狀神經(jīng)節(jié)的PCR檢測

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料 成年健康的空懷雌性關(guān)中奶山羊5只，經(jīng)放血致死后，迅速準(zhǔn)確地取出星狀前神經(jīng)節(jié)，放入液氮凍存以備用。

1.2.2 總RNA的提取 將星狀神經(jīng)節(jié)放研磨成粉末后，使用總RNA提取試劑盒TRIzol試劑盒（TaKa-Ra大連）提取總RNA，并利用紫外分光光度法在260 nm和280 nm處測量并計算RNA濃度。

1.2.3 引物設(shè)計與反轉(zhuǎn)錄 使用Primer 5軟件設(shè)計IFNGR1的引物（金斯瑞合成，南京），其序列:上游為 5＇-CTGAGGACAATCCAGGAAAAGT-3＇（共 22個核苷酸）;下游為 5＇-TCTTTACCACCTTCATCCACAA-3＇（共22個核苷酸）。內(nèi)參物β-actin引物序列:上游為（20個核苷酸）5＇-ATGGTGGGTATGGGTCAGAA-3＇;下游為 5＇-CGGAGCTCGTTGTAGAAGGT-3＇（共20個核苷酸）。RNA反轉(zhuǎn)錄根據(jù)試劑盒（試劑盒，TaKaRa大連）說明書操作，反應(yīng)條件:37℃15min，85℃ 5 s。反應(yīng)總體系（20μl）包括:Oligo dT Primer（50 mmol/L）1 μl，5×PrimerScript Buffer 4 μl，Random 6 mers（100 mmol/L）1 μl，PrimerScript Enzyme MixⅠ1 μl，Total RNA 4 μl，RNase free water 9μl。反應(yīng)結(jié)束后將所得的cDNA放置于-20℃?zhèn)溆帽４妗?/p>

1.2.4 PCR擴(kuò)增目的基因 PCR擴(kuò)增以β-actin作為內(nèi)參，根據(jù)Ferment Mix試劑盒（Ferment USA）說明操作。PCR反應(yīng)體系（總體積25μl）包括:cDNA 2 μl，Mix 12.5 μl，下游引物 1 μl，上游引物 1 μl，ddH2O 8.5μl。充分吹打混勻后，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性（5 min）;94℃變性（40 s），60℃退火（40 s），72℃延伸（1 min），共經(jīng)過40個循環(huán);72℃延伸（5 min）。將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物放置于-4℃?zhèn)溆帽４婊蛑苯邮褂谩?/p>

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物 將所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。使用紫外凝膠成像系統(tǒng)，觀察凝膠上是否有白色DNA熒光目標(biāo)條帶，并將結(jié)果通過凝膠成像系統(tǒng)拍照以便保存。

1.2.6 IFNGR部分基因序列的測定及結(jié)果分析將擴(kuò)增成功的擴(kuò)增產(chǎn)物50μl送至物科技公司（金斯瑞，南京）進(jìn)行DNA序列的雙向測序，并將測定結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比較和確認(rèn)，并與其他物種的序列進(jìn)行了同源性比對。

2 結(jié)果

2.1 頸胸神經(jīng)節(jié)HE和免疫組織化學(xué)SP法染色結(jié)果 光鏡下，空白對照組（見圖1Ⅱ）無著色，為陰性，試驗(yàn)組IFNGR免疫陽性產(chǎn)物均呈褐色顆粒，說明IFNGR的SP染色具有特異性反應(yīng)。根據(jù)染色程度，可將IFNGR染色結(jié)果分為四個等級:①陰性:無著色;②弱陽性:染色弱，呈淡黃色;③中等陽性:中等染色，呈黃褐色;④強(qiáng)陽性:染色強(qiáng)，呈棕褐色。

結(jié)果顯示，在星狀神經(jīng)節(jié)內(nèi)IFNGR免疫陽性產(chǎn)物廣泛分布。在神經(jīng)元（見圖1Ⅲ，1ⅣA）中均有分布。神經(jīng)元細(xì)胞膜（圖1Ⅲ，ⅣD）上IFNGR免疫陽性產(chǎn)物呈顆粒狀分布，著色為黃褐色，呈中等陽性。神經(jīng)元胞質(zhì)（見圖1Ⅲ，ⅣC）著色表現(xiàn)差異性，胞體直徑較小的神經(jīng)元著色較深，為黃褐色，呈中等陽性，少數(shù)胞體直徑較大的神經(jīng)元胞質(zhì)染色弱，為淡黃色或無色，呈弱陽性或陰性。神經(jīng)元細(xì)胞核（見圖1Ⅲ，1ⅣB）著色表現(xiàn)出差異性，91.87%的神經(jīng)元細(xì)胞核呈陽性著色，核質(zhì)部分明顯呈棕褐色，為強(qiáng)陽性，而核仁染色相對較弱或無著色，為弱陽性或陰性;8.13%的細(xì)胞核染色弱呈淡黃色或無色，為弱陽性或陰性。衛(wèi)星細(xì)胞（見圖1Ⅲ，1ⅣF）染色情況不一，有的呈棕褐色，為強(qiáng)陽性，有的呈棕色，為中等陽性。神經(jīng)纖維（見圖1Ⅲ，1ⅣG）、血管內(nèi)皮細(xì)胞（見圖1ⅣI）等也有免疫陽性產(chǎn)物存在，呈黃褐色或淡黃色，為中等陽性或弱陽性。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示:在星狀神經(jīng)節(jié)中，IFNGR主要分布于神經(jīng)元胞體，其相對表達(dá)量為75.98±5.80，高于過路纖維、衛(wèi)星細(xì)胞等非神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的4.57±1.88，兩者相比較差異極顯著（P＜0.01）。

圖1 IFNGR在星狀神經(jīng)節(jié)的HE染色和免疫組化染色Fig.1 HE and immunohistochem ical stains of IFNGR in stellate ganglion of female goat

2.2 IFNGR1 PCR檢測結(jié)果

2.2.1 IFNGR1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 在雌性山羊星狀神經(jīng)節(jié)IFNGR1中擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物在376 bp處有一個清晰的白色目標(biāo)條帶，β-actin PCR產(chǎn)物在150 bp處有一條清晰的白色條帶，見圖2。

將所得到的序列在NCBI上進(jìn)行同源性比對顯示:山羊與綿羊基因同源性最高（98%，XM_004011371.1），其次為牛（97%，NM_001035063.1），與褐家鼠（66%，NM_053783.1）的基因同源性最低。

圖2 星狀神經(jīng)節(jié)IFNGR1部分cDNA PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR product of IFNGR1 cDNA

3 討論

在動物生產(chǎn)實(shí)際中，除了少數(shù)雄性動物留作種用外，大部分的雄性動物都被閹割做肉用，雌性動物承擔(dān)了生產(chǎn)的主要任務(wù)。山羊作為反芻動物的一個代表，在實(shí)際生產(chǎn)中更是如此。星狀神經(jīng)節(jié)對心血管活動具有重要的調(diào)節(jié)作用。但是雌性山羊與雄性山羊的生理狀態(tài)及生活習(xí)性存在較大的差別，并且雌性山羊懷孕期間的神經(jīng)免疫內(nèi)分泌機(jī)制明顯不同于雄性山羊。因此，本研究綜合生產(chǎn)實(shí)踐與生物學(xué)研究的需求，選擇以雌性山羊?yàn)檠芯繉ο髾z測IFN-γ受體在星狀神經(jīng)節(jié)的表達(dá)情況。

IFN-γ具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ在免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)均有分布［2］。IFN-γ具有抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增生的作用［16］。Karise等［17］曾報告IFN-γ能輕度刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放內(nèi)皮素（ET），內(nèi)皮素不僅是強(qiáng)烈的血管收縮劑，而且具有強(qiáng)烈的促血管平滑肌細(xì)胞增殖的效應(yīng)［18］。研究還發(fā)現(xiàn)IFN-γ不僅能抑制平滑肌細(xì)胞增殖，還可通過激活細(xì)胞表面的Fas配體從而誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的凋亡，并且IFN-γ還能刺激組織因子、MCP-1以及 CD40 的表達(dá)［9］。Liuzzo 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ能通過激活單核細(xì)胞，降解膠原蛋白和彈力蛋白，使得動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定而破裂，起到緩解動脈粥樣硬化的作用。Eid等［8］對冠狀動脈血管壁的炎癥反應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞浸潤冠狀動脈并產(chǎn)生IFN-γ，它對血管平滑肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)起促進(jìn)作用。以上資料表明IFN-γ可以直接或者間接地作用于心血管，對其功能活動及免疫活動起到一定的調(diào)節(jié)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ廣泛分布并作用于神經(jīng)系統(tǒng)中。Kiefer等［2］曾報道，INF-γ樣免疫反應(yīng)產(chǎn)物分布于大鼠下丘腦乳頭體核和中腦背側(cè)被蓋內(nèi)，在外周神經(jīng)系統(tǒng)，交感神經(jīng)星狀神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、脊神經(jīng)節(jié)小細(xì)胞和胃腸道副交感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中都有IFN-γ免疫陽性產(chǎn)物的廣泛分布。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在山羊星狀神經(jīng)節(jié)中IFNGR免疫陽性產(chǎn)物分布廣泛，在神經(jīng)元中均有分布，主要分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞核上;星狀神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元胞體中IFNGR的相對表達(dá)量與過路纖維相比差異極顯著（P＜0.01）。同時，PCR擴(kuò)增到的星狀神經(jīng)節(jié)IFNGR1基因的cDNA片段全長376 bp，并且與綿羊基因同源性最高（98%），其次為牛（97%）。表明在山羊星狀神經(jīng)節(jié)中IFNGR主要在交感節(jié)后神經(jīng)元表達(dá)和分布，具備對IFN-γ刺激做出反應(yīng)的條件，提示山羊體內(nèi)的星狀神經(jīng)節(jié)的交感節(jié)后神經(jīng)元是IFN-γ主要作用的靶細(xì)胞。

研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ可以直接作用于神經(jīng)元進(jìn)而調(diào)節(jié)其功能活動。Song等［19］研究表明，IFN-γ可以誘導(dǎo)神經(jīng)分化，促進(jìn)神經(jīng)突起生長。IFN-γ還可以促進(jìn)并維持體外培養(yǎng)的皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元的神經(jīng)突分支的形成［20］。Lein［21］用從大鼠頸前神經(jīng)節(jié)分離的交感神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)證明IFN-γ可以直接作用于神經(jīng)元而使樹突收縮。而IFN-γ的生物活性的發(fā)揮是由IFNGR介導(dǎo)的。所以上述資料表明IFN-γ可以直接作用于神經(jīng)元上的IFNGR而影響神經(jīng)元的活動。本試驗(yàn)結(jié)果表明雌性山羊星狀神經(jīng)節(jié)中的交感節(jié)后神經(jīng)元的細(xì)胞膜和細(xì)胞核中IFNGR廣泛表達(dá)和分布。因此，星狀神經(jīng)節(jié)中的交感節(jié)后神經(jīng)元是IFN-γ主要作用的靶細(xì)胞。所以，IFN-γ可以直接作用于星狀神經(jīng)節(jié)中的交感節(jié)后神經(jīng)元而影響神經(jīng)元的活動。這種影響的意義在于山羊星狀神經(jīng)節(jié)可能作為IFN-γ對心血管免疫調(diào)節(jié)途徑和自主神經(jīng)對心血管調(diào)節(jié)的神經(jīng)途徑之間相互協(xié)調(diào)的關(guān)鍵點(diǎn)。

4 結(jié)論

IFNGR免疫陽性產(chǎn)物在關(guān)中奶山羊星狀神經(jīng)節(jié)中廣泛分布，IFNGR在神經(jīng)元胞體的相對表達(dá)量極顯著高于非神經(jīng)元胞體結(jié)構(gòu)（P＜0.01）。同時PCR擴(kuò)增到的山羊星狀神經(jīng)節(jié)IFNGR1基因的cDNA片段全長376 bp，并且與綿羊基因同源性最高（98%），其次為牛（97%），說明IFNGR在山羊星狀神經(jīng)節(jié)中有表達(dá)和分布，山羊星狀神經(jīng)節(jié)交感節(jié)后神經(jīng)元具有對IFN-γ刺激反應(yīng)的受體。提示IFN-γ可能通過影響星狀神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元的活動，進(jìn)而影響星狀神經(jīng)節(jié)支配的很多組織器官如心臟、血管、汗腺等組織器官的活動，其意義在于星狀神經(jīng)節(jié)的交感節(jié)后神經(jīng)元有可能是IFN-γ作用于心血管等組織器官的免疫內(nèi)分泌途徑和自主神經(jīng)途徑之間相互協(xié)調(diào)的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

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［收稿2013-11-26 修回2013-12-25］

（編輯 張曉舟）

Expression characteristic of IFNGR in stellate ganglion of female goats

LIQiang，WANGZhi-Hao，JINXiu-Fang，XUYong-Ping，GUOXiao，CHENWen-Dong，DONGWei.Collegeof VeterinaryMedicine，NorthwestA＆FUniversity，Yangling712100，China

Objective:To detect the existence of IFNGR in the stellate ganglion in female goats.Methods:The stellate ganglia were taken from female goats.The expression of IFNGR was detected by PCRmethod and immunohistochemical SP staining.Results:The results showed that:IFNGR immunoreactive substanceswere distributed in neurons，supporting cells and passing fiber，andmainly in the cytomembrane and nuclei of neurons.The relative expression of IFNGR was very significantly higher than that of non-neuronal cells（P ＜0.01）.The sequence of IFNGR1 gene amplified by PCRmethod contained 376 bp，and IFNGR1 gene ofgoats exhibited the highest homology with sheep（98%），followed by cattle（97%）.Conclusion:The results suggested that the IFNGR in the Stellate Ganglion of female goatsmainly expressed and located in sympathetic postganglionic neuronswhich were provided with the conditions for the role of IFN-γ，which implied that the Stellate Ganglionmay actas the critical point to concert the immune regulation of IFN-γ and neuroregulation of autonomic nerve on cardiovascular system.

Interferon-γ receptors;Stellate ganglion;Immunohistochemical SPmethod;PCR;Goats

S852.4

A

1000-484X（2014）05-0604-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.007

①本文為國家自然科學(xué)基金項目（31072184）和陜西省農(nóng)業(yè)推廣項目（k332021309）。

李 強(qiáng)（1987年-），男，主要從事發(fā)育生物學(xué)研究，E-mail:dkyliqiang@sina.com。

及指導(dǎo)教師:徐永平（1971年-），碩士生導(dǎo)師，主要從事動物神經(jīng)免疫內(nèi)分泌的分子機(jī)制、動物生殖調(diào)控 機(jī) 理 研 究，E-mail:xuyp717@nwsuaf.edu.cn。