游曉星 馬小華 劉良專 曾焱華 朱翠明 何 軍 蔣傳好 吳移謀

（南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，衡陽 421001）

支原體脂肽經(jīng)TLR2，6/c-Src/PI3K通路誘導(dǎo)單核細胞表達血紅素氧合酶-1①

游曉星 馬小華②劉良專 曾焱華 朱翠明 何 軍③蔣傳好 吳移謀

（南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，衡陽 421001）

目的:觀察支原體巨噬細胞活化脂肽2（Macrophage-activating lipopeptide-2，MALP-2）誘導(dǎo)人單核細胞系THP-1表達血紅素氧合酶-1（Hemeoxygenase，HO-1）的分子機制。方法:體外培養(yǎng)THP-1細胞，用不同濃度的MALP-2作用12 h，Western blot檢測HO-1的表達。THP-1細胞經(jīng)TLR2和TLR6中和抗體孵育，或構(gòu)建TLR2和TLR6負顯性突變體轉(zhuǎn)染細胞，以明確TLR2和TLR6在介導(dǎo)HO-1表達中的作用;Western blot檢測c-Src和Akt磷酸化情況，同時，分別采用c-Src siRNA或PI3K抑制劑LY294002處理細胞，觀察c-Src及PI3K在HO-1表達中的作用。結(jié)果:MALP-2處理后可磷酸化c-Src，而TLR2和TLR6中和抗體以及其負顯性突變體轉(zhuǎn)染后，c-Src磷酸化水平顯著降低;同時，c-Src siRNA可降低Akt磷酸化水平，而PI3K抑制劑LY294002處理后可明顯降低HO-1的表達。結(jié)論:MALP-2能誘導(dǎo)THP-1細胞表達HO-1，其機制可能受TLR2，6/c-Src/PI3K通路調(diào)控。

支原體巨噬細胞活化脂肽2;血紅素氧合酶-1;單核細胞

支原體是一類能引起非典型肺炎、非淋球菌性 尿道炎以及生殖系統(tǒng)炎癥等疾病的原核細胞型微生物［1，2］。支原體感染宿主后，首先經(jīng)單核、巨噬細胞表面的Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）所識別，隨后在接頭分子MyD88和Mal的介導(dǎo)下，通過IRAK4/IRAK1 和 TRAF6，最終激活 MAPKs、NF-κB和AP-1，并誘導(dǎo)多種炎性細胞因子（如TNF-α，IL-1β和IL-6）及介質(zhì)（ROS，NO和COX-2）的表達。這些炎癥因子和介質(zhì)構(gòu)成了復(fù)雜的協(xié)同或拮抗網(wǎng)絡(luò)，雖然對清除支原體有利，但這些分子的異常分泌，也是導(dǎo)致免疫功能異常的重要因素［3，4］。既然支原體感染可誘導(dǎo)單核巨噬細胞表達和分泌炎癥物質(zhì)，那么，機體必然存在某種調(diào)控機制使炎癥反應(yīng)趨向于穩(wěn)態(tài)，從而避免過度的組織損傷。血紅素氧合酶（Heme oxygenase）是催化血紅素降解為CO、Fe2+和膽綠素的限速酶［5］，主要有3種異構(gòu)酶（HO-1、HO-2和HO-3），其中HO-1是誘導(dǎo)型，在各種損傷性刺激下表達增高，又稱為熱休克蛋白32。研究顯示，HO-1及其代謝產(chǎn)物在維護細胞穩(wěn)態(tài)的過程中具有抗炎、抗增殖、抗氧化及抗凋亡等多重作用［6］，HO-1表達的降低或缺失使機體對氧化應(yīng)激的耐受性降低，從而誘發(fā)廣泛的氧化性損傷或器官衰竭。在前期的研究當(dāng)中，本課題組已經(jīng)證實支原體巨噬細胞活性脂肽 2（Macrophage-activating lipopeptide-2，MALP-2）可經(jīng)MAPKs途徑誘導(dǎo)單核細胞表達HO-1［7］，但其分子機制目前仍不清楚。本研究旨在探討HO-1表達的分子調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 人單核細胞系THP-1細胞購自 ATCC，MALP-2購自 Alexis Biochemicals（ALX-162-027-C050）。鼠抗人 HO-1、p-Akt及 total Akt、pc-Src及total c-Src抗體購自Cell Signaling，TLR2和TLR6中和抗體、DN-TLR2和DN-TLR6負顯性突變體質(zhì)粒購自 InvivoGen。LY294002購自Sigma-Adrich。c-Src siRNA及對照 siRNA購自 Dharmacon。蛋白酶、磷酸酶抑制劑Cocktail購自Roche，細胞蛋白提取試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo，F(xiàn)uGENE6轉(zhuǎn)染試劑購自Roche。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理 THP-1細胞用含10%FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MALP-2刺激前，THP-1細胞于1 000 r/min離心5min，無菌PBS洗滌后，用含1%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液于6孔板中調(diào)整其密度為 5 × 105ml－1，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。隨后用MALP-2刺激12 h。

1.3 Western blot檢測HO-1表達及c-Src和Akt磷酸化 細胞刺激結(jié)束后，用預(yù)冷的無菌PBS洗滌，迅速置于冰上，按蛋白提取試劑盒提供的步驟獲取細胞總蛋白并測定其濃度。取80μg蛋白加入等體積的2×SDS上樣緩沖液煮沸5 min后用于SDSPAGE。隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，并利用含5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h，隨后加入一抗4℃孵育過夜。多次洗滌后，加入 HRP標(biāo)記的二抗孵育膜1 h。ECL法發(fā)光、顯影。

1.4 瞬時轉(zhuǎn)染負顯性質(zhì)粒及siRNA 約5×104細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板過夜。隨后按照Fu-GENE6提供的操作步驟，將DN-TLR2或DN-TLR6質(zhì)粒，或c-Src siRNA混合物孵育細胞。轉(zhuǎn)染24 h后，用PBS漂洗細胞，并用1%FBS維持24 h后再用MALP-2刺激12 h。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prizm軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)用x－±s表示，并采用單因素方差分析數(shù)據(jù)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MALP-2誘導(dǎo)THP-1細胞表達HO-1 Western blot結(jié)果顯示，0.01 ng/ml MALP-2作用THP-1細胞12 h后，即可明顯誘導(dǎo)HO-1表達，且隨著MALP-2濃度的增高，HO-1表達逐漸增多。其中5 ng/ml MALP-2處理后，HO-1表達增加了3.2倍，而此時尚未出現(xiàn)細胞毒性作用（MTT結(jié)果未顯示），見圖1。

2.2 TLR2，6介導(dǎo) MALP-2誘導(dǎo)HO-1產(chǎn)生 THP-1細胞用MALP-2刺激前，分別與不同濃度TLR2或TLR6中和抗體孵育1 h，隨后 MALP-2刺激12 h。Western blot結(jié)果顯示，TLR2和TLR6中和抗體均能有效抑制MALP-2誘導(dǎo)HO-1表達（圖2A、B）。此外，THP-1細胞轉(zhuǎn)染TIR區(qū)域突變的TLR2負顯性突變體（DN-TLR2）或DN-TLR6后，再用MALP-2刺激，結(jié)果顯示HO-1表達顯著降低（圖2C、D）。

2.3 MALP-2能誘導(dǎo)c-Src磷酸化 Western blot結(jié)果顯示，MALP-2作用THP-1細胞3～5 min后即可誘導(dǎo)c-Src（Tyr416）磷酸化，隨后隨著時間的延長，磷酸化水平逐漸降低。而細胞內(nèi)總c-Src含量保持不變（圖3A）。此外，細胞轉(zhuǎn)染DN-TLR2和DN-TLR6后，磷酸化c-Src顯著降低（圖3B）。

2.4 c-Src參與HO-1表達 采用siRNA干擾c-Src表達后，再用MALP-2作用12 h，結(jié)果顯示，HO-1表達顯著降低，見圖4。

2.5 c-Src誘導(dǎo)Akt磷酸化從而誘導(dǎo)HO-1表達

MALP-2作用THP-1細胞5 min即可誘導(dǎo)PI3K下游產(chǎn)物 Akt磷酸化（圖5A）。此外，細胞轉(zhuǎn)染 c-Src siRNA后，磷酸化Akt顯著降低 （圖5B）。而 THP-1預(yù)先經(jīng)不同濃度PI3K特異性抑制劑LY294002處理后，再用MALP-2刺激12 h，HO-1表達隨之降低（圖5C）。

圖1 MALP-2誘導(dǎo)THP-1細胞表達HO-1蛋白Fig.1 MALP-2 induces THP-1 cells expression of HO-1 protein

圖2 TLR2或TLR6介導(dǎo)MALP-2誘導(dǎo)THP-1細胞表達HO-1Fig.2 TLR2 and TLR6 mediates MALP-2 induced HO-1 expression in THP-1 cells

圖3 MALP-2誘導(dǎo)THP-1細胞中c-Src磷酸化Fig.3 MALP-2 induces c-Src phosphorylation in THP-1 cells

3 討論

圖4 siRNA干擾c-Src表達抑制HO-1產(chǎn)生Fig.4 c-Src siRNA abrogate HO-1 induction

圖5 MALP-2經(jīng)c-Src/PI3K誘導(dǎo)THP-1表達HO-1Fig.5 MALP-2-induced HO-1 expression ismediated by c-Src/PI3K

支原體缺乏其他細菌的致病物質(zhì)內(nèi)毒素，其細胞膜中的脂蛋白是主要的致炎物質(zhì)［3，4，8］。支原體膜脂蛋白由N-二乙酰半胱氨酸結(jié)構(gòu)和與之結(jié)合的多肽組成，其中N端乙酰半胱氨酸是其生物學(xué)活性的基礎(chǔ)。理論上說提取膜脂蛋白是研究其感染與免疫機制的最佳物質(zhì)，然而在支原體體外培養(yǎng)以及蛋白提取過程中極易受到內(nèi)毒素污染，且常規(guī)方法難以去除。MALP-2最初是從發(fā)酵支原體脂蛋白中分離出的一種脂肽，是活化單核、巨噬細胞最強的刺激物之一，常用于體外模擬支原體脂蛋白刺激或TLR2的激動劑。支原體脂蛋白/MALP-2被單核巨噬細胞識別后，可誘導(dǎo)機體分泌多種炎癥因子和介質(zhì)，這些物質(zhì)雖然有利于清除支原體，但為了避免炎癥失控以及自身凋亡的發(fā)生，機體具備多種自我保護機制發(fā)揮對炎癥的負調(diào)控。在前期研究中，本課題組發(fā)現(xiàn)MALP-2可誘導(dǎo)THP-1細胞表達和產(chǎn)生HO-1而負調(diào)COX-2的過度表達［7］。本研究對其分子機制進行了進一步探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MALP-2誘導(dǎo)HO-1表達是通過TLR2，6/c-Src/PI3K通路而實現(xiàn)的。

TLR2，6是識別支原體的主要受體［9］。本研究采用TLR2和TLR6特異性中和抗體封閉后，HO-1表達明顯降低。但單純的抗體封閉并不能完全體現(xiàn)TLR2和TLR6在介導(dǎo)HO-1表達中的作用，隨后采用TIR區(qū)域突變的TLR2，6負顯性突變體轉(zhuǎn)染THP-1細胞后，也得到了類似的結(jié)果，這表明TLR2和TLR6均參與了MALP-2介導(dǎo)的HO-1表達。

c-Src是Src酪氨酸蛋白激酶家族中高度保守的一種激酶，是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，參與細胞內(nèi)多種生理功能，如免疫應(yīng)答、抗原提成以及生長增殖等，并介導(dǎo) TLR2信號通路從而激活 NF-κB［10，11］。未激活情況下，c-Src 第 527 位酪氨酸處于磷酸化狀態(tài)而失活。在外源性刺激下，527位酪氨酸殘基去磷酸化，隨后導(dǎo)致416位酪氨酸自身磷酸化而被激活［12］。本研究證實，MALP-2處理后可顯著誘導(dǎo)416位酪氨酸磷酸化，且采用TLR2或TLR6負顯性突變體轉(zhuǎn)染后，其磷酸化水平大大降低，表明c-Src是TLR2，6信號通路中發(fā)揮重要作用。隨后通過RNA干擾后，不但可抑制HO-1的產(chǎn)生，同時也能抑制PI3K的激活。

PI3K是參與細胞生長以及骨架重塑的重要激酶，其激活后可導(dǎo)致脂質(zhì)底物磷酸化而形成第二信使，并激活下游蛋白激酶B，即Akt。因此檢測Akt的磷酸化可間接反映PI3K的激活［13］。有研究顯示TLR2和相應(yīng)配體結(jié)合后，可與PI3K形成復(fù)合體而參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［14］。本研究證實MALP-2處理后能明顯誘導(dǎo)Akt磷酸化，而RNA干擾c-Src表達后，Akt磷酸化明顯降低，這表明c-Src位于PI3K上游。PI3K抑制劑處理THP-1細胞后，HO-1表達明顯降低，這表明HO-1受TLR2，6/c-Src/PI3K調(diào)控。

總之，本研究證實 MALP-2可通過 TLR2，6/c-Src/PI3K信號通路反饋性誘導(dǎo)HO-1表達，從而維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。但由于MALP-2的主要生物學(xué)特性是致炎作用，因此若能從結(jié)構(gòu)上對MALP-2進行改造，降低其致炎活性而保留HO-1的誘導(dǎo)活性，有望為支原體或其他感染性疾病的治療提供一個新的治療手段。

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［收稿2013-10-40 修回2013-11-29］

（編輯 許四平）

A m ycoplasma lipopeptide induces hemeoxygenase-1 expression via TLR2，6/c-Src/PI3K pathway in monocytes

YOUXiao-Xing，MAXiao-Hua，LIULiang-Zhuan，ZENGYan-Hua，ZHUCui-Ming，HEJun，JIANGChuan-Hao，WUYi-Mou.InstitutionofPathogenicBiology，MedicalCollege，UniversityofSouthChina，Hengyang421001，China

Objective:To observe themolecularmechanism involved in expression of hemeoxygenase-1（HO-1）induced by a macrophage-activating lipopeptide-2（MALP-2）.Methods:THP-1 cells were cultured in vitro and stimulated by MALP-2 for 12 h，expression of HO-1 was detected by Western blot.TLR2 and TLR6 neutralizing antibodies incubation，dominant negative plasmids transfection were used to assess the functional of TLR2，6 inmediating HO-1 expression.Phosphorylation of c-Src and Aktwere detected by Western blot，and c-Src siRNA and PI3K inhibitor LY294002 were used to investigate the role of c-Src and PI3K in HO-1 expression.Results:MALP-2 induced c-Src phosphorylation，and TLR2 and TLR6 neutralizing antibodies，or their dominant negatively plasmids could abrogate this effect.In addition，siRNA of c-Src could decrease the phosphorylation level of Akt，and the PI3K inhibitor could inhibit HO-1 expression.Conclusion:MALP-2 can induce THP-1 cells expression of HO-1 through TLR2，6/c-Src/PI3K pathways.

Macrophage-activating lipopeptide-2;Hemeoxygenase-1;Monocyte

R392.9

A

1000-484X（2014）05-0587-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.003

①本文為國家自然科學(xué)基金（31000091，81072418）、湖南省高?？萍紕?chuàng)新團隊資助項目（湘教通［2010］212號）、湖南省研究生培養(yǎng)創(chuàng)新基金資助項目（湘教通〔2008〕249號）。

②長沙市中心醫(yī)院，長沙410004。

③南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，衡陽421001。

游曉星（1980年－），男，博士，主要從事支原體的感染與免疫機制研究，E-mail:youxiaoxing2013@gmail.com。

及指導(dǎo)教師:吳移謀（1954年－），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事病原體的致病機制、快速診斷與防治研究，E-mail:yimouwu@sina.com。