樊 宇 楊 春 張璐渝 楊 靜 何永林 徐 蕾 馮 鑫 張春燕 穆柳青（重慶醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室，重慶 400016）

hsa-microRNA-218對顆粒溶素表達(dá)影響的探討①

樊 宇 楊 春 張璐渝②楊 靜 何永林 徐 蕾 馮 鑫 張春燕 穆柳青（重慶醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室，重慶 400016）

目的:探討hsa-microRNA-218（hsa-mir-218）對顆粒溶素（Granulysin，GLS）表達(dá)的影響。方法:抽提佛波酯（Phorbol12-myristate 13-acetatefor，PMA）激活的THP-1細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增GLS基因，將其克隆至pDsRed-Express-C1，構(gòu)建GLS表達(dá)質(zhì)粒pDsRed-GLS。將pDsRed-GLS與pGenesil-mir-218（pGenesil-mir-control）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，36 h后激光共聚焦顯微鏡觀察兩種質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)情況，48 h后提取細(xì)胞總RNA和蛋白，RT-PCR和Western blot檢測hsa-mir-218對GLS表達(dá)的影響。結(jié)果:酶切和測序結(jié)果證實重組質(zhì)粒pDsRed-GLS構(gòu)建成功，且能與microRNA干擾質(zhì)粒在293T細(xì)胞中共表達(dá)。與轉(zhuǎn)染pGenesil-mir-control組細(xì)胞相比，Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pGenesil-mir-218組細(xì)胞GLS蛋白表達(dá)下降約50%，而GLSmRNA表達(dá)無明顯變化。結(jié)論:hsa-mir-218在轉(zhuǎn)錄后水平干擾了GLS的表達(dá)，為進(jìn)一步探討mir-218干擾GLS表達(dá)的機(jī)制打下基礎(chǔ)。

顆粒溶素;293T細(xì)胞;RNA干擾;激光共聚焦

顆粒溶素（Granulysin，GLS）是由 NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞胞漿顆粒分泌的天然抗菌肽，對結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteria Tuberculosis，MTB）有較好的殺菌作用。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)GLS能激發(fā)機(jī)體特異性Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，對MTB感染的小鼠有一定的免疫保護(hù)和治療作用［1］。但是臨床研究表明結(jié)核病人體內(nèi)GLS的表達(dá)明顯下降，疾病治愈后GLS 表達(dá)回升［2，3］，GLS 表達(dá)量與疾病程度負(fù)相關(guān)的具體機(jī)制尚不清楚?？紤]到microRNA的負(fù)向調(diào)控作用［4］，我們在前期實驗中成功篩選出與GLS表達(dá)相關(guān)的 microRNA（hsa-mir-218）［5］，它通過作用于顆粒溶素3’-UTR影響熒光素酶的表達(dá)，但hsa-mir-218能否干擾GLS蛋白的表達(dá)尚未驗證。本實驗擬將GLS蛋白表達(dá)質(zhì)粒與microRNA干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，觀察hsa-mir-218對GLS蛋白表達(dá)的干擾效果，為進(jìn)一步探討mir-218干擾GLS表達(dá)的機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒及菌株 人腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞、人單核白血病 THP-1細(xì)胞、pGenesil-mir-218、pGenesil-mir-control、感受態(tài)大腸桿菌Top10由重慶醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室保存，pDsRed-Express-C1由上海獸醫(yī)研究所孟春研究員饋贈。

1.2 主要試劑 DNA marker DL2000、高保真DNA聚合酶、膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ及Kpn I、Total RNA 提取試劑（RNAisoTMPlus）、RTPCR（PrimeScriptTMRT reagent Kit）試劑盒、DEPC均購自TaKaRa公司;T4 DNA連接酶購自Promega公司;質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自O(shè)MEGA公司;Taq酶和BCA試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;小鼠抗人GLS多克隆抗體購自abcam公司;小鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Western及IP細(xì)胞裂解液、ECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基和0.25%胰酶購自Gibco公司;phorbol-12-myristate-13-acetate（PMA）、Ampicillin Na和Kanamycin均購自Sigma公司。

1.3 pGenesil-mir-218和 pDsRed-GLS的構(gòu)建 依據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫中hsa-mir-218序列，構(gòu)建攜帶hsa-mir-218的干擾質(zhì)粒pGenesil-mir-218，陰性對照命名為 pGenesil-mir-control［5］。

將THP-1細(xì)胞置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，常規(guī)培養(yǎng)傳代至對數(shù)生長期用于本實驗。取1×106個/孔接種于6孔板，添加PMA刺激THP-1細(xì)胞，使其終濃度為160 nmol/L。誘導(dǎo)24 h后收集細(xì)胞并按試劑盒說明提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增GLS基因。依據(jù)GenBank中登錄的GLS基因序列（NC_006433.3）用 PRIMER軟件進(jìn)行引物設(shè)計:P1:5'-GGGGTACCGTATCTGTGGTAAACCCAGT-3'（下劃線為KpnⅠ酶切位點(diǎn)），P2:5'-CGGGATCCTCTTGCTTGACACTTTATTC-3'（下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性3 min;98℃變性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸 1 min，循環(huán) 30次;72℃ 延伸 6 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

膠回收 PCR產(chǎn)物，與質(zhì)粒 pDsRed-Express-C1分別經(jīng) KpnⅠ和 BamHⅠ雙酶切，純化后，用 T4 DNA連接酶4℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌Top10，挑選陽性單菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR及酶切鑒定。鑒定正確后的質(zhì)粒命名pD-sRed-GLS，并送上海英濰捷基公司測序。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/m l青霉素、100μg/m l鏈霉素的DMEM高糖完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，按2.5×105個/孔接種于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿，待細(xì)胞匯合度達(dá)80% ～90%時，行共轉(zhuǎn)染。操作按LipofectamineTM2000試劑說明書進(jìn)行。pDsRed-GLS與pGenesil-mir-218（pGenesil-mir-control）的質(zhì)量比為1/5。

1.5 激光共聚焦 pDsRed-GLS與 pGenesil-mir-218（pGenesil-mir-control）共轉(zhuǎn)染36 h后，激光共聚焦顯微鏡下觀察兩質(zhì)粒在同一細(xì)胞中的表達(dá)情況，并拍照。

1.6 RT-PCR法檢測GLSmRNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h，用預(yù)冷的PBS輕柔洗滌293T細(xì)胞，每1×107個細(xì)胞添加1 ml RNAisoTMPlus試劑，水平放置使裂解液均勻分布于細(xì)胞表面。收集裂解后的兩組細(xì)胞溶液按操作說明提取總RNA并定量。取2μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈，以cDNA為模板PCR擴(kuò)增GLS片段。根據(jù)GenBank中登錄的GLS基因序列（NM_006433.3）和內(nèi)參人β-actin基因序列（NM_002046）設(shè)計引物，序列如下:GLS p1:5'-GTATCTGTGGTAAACCC-3'，GLS p2:5'-GCTTGACACTTTATTCTCG-3';β-actin p1:5'-GGGAAATCGTGCGTGACA-3'，β-actin p2:5'-TCAGGAGGAGCAATGATC-3'。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3 min;95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán);72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收試劑盒回收后，送上海英濰捷基公司測序。

1.7 Western blot檢測細(xì)胞中GLS蛋白的表達(dá) 按操作說明用預(yù)冷的PBS洗滌293T細(xì)胞一次，添加蛋白質(zhì)抽提試劑（1 mlWestern及IP細(xì)胞裂解液+10μl PMSF），冰浴搖動5 min使其分布均勻。收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移細(xì)胞液到離心管中，冰浴搖動15 min進(jìn)行裂解，14 000×g離心15 min后，取上清蛋白質(zhì)溶液。95℃ 5 min使蛋白變性，BCA法測定蛋白濃度，每上樣槽等量上樣（50μg），蛋白樣品經(jīng)16%SDSPAGE凝膠電泳后105 V 105 min電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，封閉液封閉 1 h，用小鼠抗人 GLS抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜。次日，PBST洗滌5 min×3次，加入HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶5 000），室溫孵育2 h。均勻滴加ECL Plus化學(xué)發(fā)光檢測試劑于PVDF膜上，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)曝光采集圖像。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以x－±s表示，SPSS17.0統(tǒng)計軟件包行t檢驗，檢驗水準(zhǔn)以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pDsRed-GLS的鑒定 1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，PCR擴(kuò)增得到了長度為751 bp的GLS基因序列（圖1）。重組質(zhì)粒經(jīng)Kpn I/BamH I雙酶切后產(chǎn)生大小為751 bp的片段與預(yù)期大小相符（圖1）;測序結(jié)果表明目的基因片段與GenBank公布的序列一致（圖2）。

2.2 pDsRed-GLS 與 pGenesil-mir-218（pGenesilmir-control）在細(xì)胞內(nèi)的共表達(dá) 激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果表明:pDsRed-GLS與 pGenesil-mir-218（pGenesil-mir-control）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞36 h后，pDsRed-GLS表達(dá)的紅色熒光蛋白與pGenesil-mir-218（pGenesil-mir-control）表達(dá)的綠色熒光蛋白分布于整個細(xì)胞（圖3）。

圖1 重組質(zhì)粒pDsRed-GLS的鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasm id pDsRed-GLS

圖2 pDsRed-GLS測序鑒定結(jié)果（部分）Fig.2 Partial result of DNA sequencing of pDsRed-GLS

2.3 RT-PCR檢測GLSmRNA表達(dá)變化 RT-PCR結(jié)果顯示:與轉(zhuǎn)染pGenesil-mir-control組相比，轉(zhuǎn)染pGenesil-mir-218組GLSmRNA的表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）（圖4）。

2.4 Western blot檢測GLS蛋白表達(dá)變化 Western blot結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染pGenesil-mir-control組相比，轉(zhuǎn)染pGenesil-mir-218組GLS蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05），密度掃描半定量分析顯示GLS表達(dá)下降約50%，說明hsa-mir-218在轉(zhuǎn)錄后水平對GLS表達(dá)進(jìn)行了干擾（圖5）。

圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察pDsRed-GLS與pGenesilm ir-218（pGenesil-m ir-control）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞（×200）Fig.3 Photom icrographs of 293T cells captured 36 h after co-transfection using a laser con focal m icroscope（×200）

圖4 RT-PCR檢測GLSm RNA表達(dá)變化Fig.4 RT-PCR analysis of expression of GLSmRNA

圖5 W estern blot檢測GLS蛋白表達(dá)變化Fig.5 Western blot analysis of expression of GLS protein

3 討論

GLS是存在于NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞胞漿顆粒中的抗菌肽，它通過破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性可直接殺滅結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteria Tuberculosis，MTB）［6］，而且實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)GLS通過激發(fā)機(jī)體特異性Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，對MTB感染的小鼠能產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)和治療作用［1］。同時臨床研究顯示結(jié)核病患者體內(nèi)GLS的表達(dá)明顯下降，疾病治愈后GLS表達(dá)回升［2，3］，提示 GLS表達(dá)量與結(jié)核病病情程度負(fù)相關(guān)。為闡明其負(fù)相關(guān)的機(jī)制，我們在前期實驗中證實hsa-mir-218可使攜帶GLS 3’-UTR的熒光素酶報告質(zhì)粒表達(dá)的熒光素酶降低75%左右，表明hsa-mir-218可能對GLS的表達(dá)有干擾作用［5］。本實驗中，我們構(gòu)建GLS表達(dá)質(zhì)粒，并與hsa-mir-218干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在蛋白水平進(jìn)一步驗證hsa-mir-218對GLS的干擾效應(yīng)。

許多真核表達(dá)載體如本實驗所用pDsRed-Express-C1和pGenesil-1中含有SV40病毒的復(fù)制起始位點(diǎn)和啟動子，可以在表達(dá)SV40病毒大T抗原的細(xì)胞系中復(fù)制，從而提高外源基因的表達(dá)水平。人胚腎細(xì)胞293T就是一種表達(dá)SV40病毒大T抗原的細(xì)胞系，它來源于293細(xì)胞，經(jīng)改造后在其中插入了SV40病毒大T抗原，因此用293T細(xì)胞做轉(zhuǎn)染可以獲得較高的表達(dá)水平。且GLS是表達(dá)于CTL細(xì)胞和NK細(xì)胞胞漿顆粒中，在293T細(xì)胞不表達(dá)，于是我們構(gòu)建GLS表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，使外源GLS在293T細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，從蛋白水平驗證hsa-mir-218對外源性GLS表達(dá)的干擾效應(yīng)。

為明確GLS與hsa-mir-218在細(xì)胞中的共表達(dá)情況，分別將GLS編碼框和hsa-mir-218序列插入表達(dá)不同熒光蛋白的pDsRed-Express-C1和pGenesil-1中，激光共聚焦顯微鏡下觀察兩者的共表達(dá)情況。pDsRed-Express-C1表達(dá)的DsRed是珊瑚蟲紅色熒光蛋白的突變體，是在珊瑚蟲紅色熒光蛋白基礎(chǔ)上發(fā)生了9個氨基酸置換，使蛋白質(zhì)溶解度增加，并縮短從轉(zhuǎn)染到紅色熒光蛋白表達(dá)檢測的時間，具有寡聚化程度低、成熟速率快等優(yōu)點(diǎn)［7］。干擾載體pGenesil-1表達(dá)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）具有發(fā)光效率高、抗光漂白能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，且波長與紅色熒光激發(fā)及發(fā)射波長不重疊［8］，所以在激光共聚焦下可以清晰的分別觀察兩種熒光，以確定GLS與hsa-mir-218在細(xì)胞內(nèi)的共表達(dá)情況。

本實驗通過構(gòu)建GLS表達(dá)載體，與干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，36 h后激光共聚焦顯微鏡確認(rèn)其在細(xì)胞中共表達(dá)，48 h后分別提取總RNA和蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示GLSmRNA表達(dá)量未發(fā)生明顯改變，而GLS蛋白表達(dá)下降50%，說明hsa-mir-218在轉(zhuǎn)錄水平對GLS的表達(dá)無明顯影響，而對其在轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)有明顯干擾作用。本研究結(jié)果提示結(jié)核病患者體內(nèi)GLS表達(dá)量的變化可能與體內(nèi)某些miRNA的調(diào)節(jié)有關(guān)，而且miRNA對GLS的調(diào)節(jié)作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，這為進(jìn)一步探討mir-218干擾GLS表達(dá)的機(jī)制打下基礎(chǔ)，同時為利用miRNA防治結(jié)核病提供了新的思路。

［1］ Yang C，He YL，Zhang L，et al.GLS/IL-12-modified Mycobacterium smegmatis as a novel anti-tuberculosis immunotherapeutic vaccine［J］.Int JTuberc Lung Dis，2009，13（11）:1360-1366.

［2］ Andersson J，Samarina A，F(xiàn)ink J，et al.Impaired expression of perforin and granulysin in CD8+T cells at the site of infection in human chronic pulmonary tuberculosis［J］.Infect Immun，2007，75（11）:5210-5222.

［3］ Di Liberto D，Buccheri S，Caccamo N，et al.Decreased serum granulysin levels in childhood tuberculosiswhich reverse after therapy［J］.Tuberculosis（Edinb），2007，87（4）:322-328.

［4］ Bartel DP.MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116（2）:281-297.

［5］ 楊 靜，楊 春，何永林，等.GLS 3’-非編碼區(qū)-熒光素酶報告質(zhì)粒的構(gòu)建及其活性鑒定［J］.免疫學(xué)雜志，2013，29（1）:33-37.

［6］ Krensky AM，Clayberger C.Biology and clinical relevance of granulysin［J］.Tissue Antigens，2009，73（3）:193-198.

［7］ 郝麗梅，李唐棣，梅興國.紅色熒光蛋白的研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)·藥學(xué)分冊，2006，33（2）:131-133.

［8］ Paul BK，Guchhait N.Looking at the Green Fluorescent Protein（GFP）chromophore from a different perspective:a computational insight［J］.Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc，2013，103:295-303.

［收稿2013-11-19 修回2013-12-02］

（編輯 許四平）

Effect of hsa-m icroRNA-218 on granulysin expression

FANYu，YANGChun，ZHANGLu-Yu，YANGJing，HEYong-Lin，XULei，F(xiàn)ENGXin，ZHANGChun-Yan，MULiu-Qing.DepartmentofMicrobiology，ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China

Objective:To elucidate the effect of hsa-microRNA-218（hsa-mir-218）on exogenous granulysin（GLS）expression in 293T cells.Methods:Total RNA was extracted from THP-1 cells induced by phorbol12-myristate 13-acetatefor（PMA），and GLS gene was amplified by RT-PCR，and then cloned into pDsRed-Express-C1 to construct the GLS expression vector pDsRed-GLS.Then 293T cells were co-transfected with pDsRed-GLSand pGenesil-mir-218（pGenesil-mir-control）and laser confocalmicroscopy was performed 36 h later to detect their co-expression.Total RNA and protein were extracted 48 h post transfection，and RT-PCR and Western blot were performed to detect the effectofhsa-mir-218 on exogenous GLSexpression.Results:The GLSexpression vector pDsRed-GLS was constructed successfully and laser confocalmicroscopy indicated that it was co-expressed with the interference vector.Compared with thatof cells transfected with pGenesil-mir-control，Western blot showed amarkedly decrease of GLSprotein expression（50%）in the cells transfected with pGenesil-mir-218.However，GLSmRNA expression remained unchanged.Conclusion:hsa-mir-218 negatively regulates GLS expression at a post-transcriptional level，and this provides an experimental basis for future study ofmechanism of GLS expression regulated bymir-218.

Granulysin;293T cells;RNA interference;Laser confocalmicroscopy

R378.91+1

A

1000-484X（2014）05-0596-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.005

①本文為國家自然科學(xué)基金項目（No.30901280）。

②通訊作者，E-mail:zly1962@yahoo.com.cn，重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，重慶 400016。

樊 宇（1988年－），男，主要從事結(jié)核分枝桿菌感染與免疫研究。

及指導(dǎo)教師:楊 春（1964年－），女，博士，教授，教研室主任，碩士生導(dǎo)師，主要從事細(xì)菌感染與免疫研究，E-mail:yangchunim@163.com。