李梅華 鐘小寧 文明智 何志義 彭信言 （廣西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸科，南寧 530021）

紅霉素對香煙煙霧刺激的人巨噬細胞組蛋白去乙?；?表達影響的實驗研究①

李梅華 鐘小寧 文明智 何志義 彭信言 （廣西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸科，南寧 530021）

目的:探討紅霉素對香煙煙霧刺激的人巨噬細胞組蛋白去乙?；?（HDAC3）表達的影響。方法:體外培養(yǎng)人類單核細胞系U937細胞，用佛波脂（PMA）將其誘導分化為人巨噬細胞。按傳統(tǒng)方法制備好香煙煙霧提取物（CSE）用于實驗。將傳代后的細胞分組:對照組、CSE組、紅霉素+CSE組、HDAC特異性抑制劑曲古霉素（TSA）組。采用比色法檢測細胞HDAC總活性;Western blot檢測HDAC3和NF-κB蛋白表達;通過酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測細胞上清液中TNF-α的濃度。結(jié)果:1%CSE刺激人巨噬細胞引起細胞HDAC總活性減弱和HDAC3蛋白表達下降，誘導轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性增高，釋放TNF-α;紅霉素（1μg/m l）預孵育24 h可以增強CSE抑制的巨噬細胞HDAC3蛋白表達，下調(diào)NF-κB蛋白表達，抑制TNF-α的合成和釋放。結(jié)論:紅霉素通過上調(diào)HDAC3蛋白表達水平而抑制香煙煙霧誘導增強的轉(zhuǎn)錄因子NF-кB活性，進而影響炎癥介質(zhì)TNF-α的合成調(diào)控。

紅霉素;組蛋白去乙?；?;香煙煙霧

現(xiàn)在越來越多的證據(jù)支持大環(huán)內(nèi)酯類藥物（紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素）作為免疫調(diào)節(jié)劑治療方案在慢性肺部疾病，包括彌漫性泛細支氣管炎、肺囊性纖維化、支氣管哮喘和慢性阻塞性肺疾?。–OPD）等的應用［1-3］。近期一些研究表明［4，5］，長期小劑量應用大環(huán)內(nèi)酯類治療 COPD 取得了較好的效果。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)紅霉素可以抑制支氣管上皮細胞IL-8、細胞間黏附因子（ICAM-1）的合成和釋放，與抑制轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB、激活蛋白-1（AP-1）活性有關［6］，但有關紅霉素抑制炎癥基因轉(zhuǎn)錄活化的細胞內(nèi)信號傳導途徑目前尚不清楚，因此我們在本實驗中探討紅霉素抵抗香煙煙霧所誘導的炎癥機制中的細胞內(nèi)信號傳導途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 佛波脂（PMA）:美國Sigma公司產(chǎn)品;甲天下牌香煙（焦油:15 mg，煙堿:1.1 mg）:廣西南寧卷煙廠;紅霉素:美國Sigma公司產(chǎn)品;IL-8酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測試劑盒:美國RD公司產(chǎn)品;DIG凝膠遷移率試劑盒:瑞士Roche公司產(chǎn)品;核蛋白提取試劑盒:美國Pierce公司產(chǎn)品;BCA蛋白濃度測定試劑盒:美國Pierce公司產(chǎn)品;HDAC活性測定試劑盒:美國Santa Crus公司產(chǎn)品;HDAC3多克隆抗體:美國Santa Crus公司產(chǎn)品。人類單核細胞系細胞株（U937細胞）從中國科學院細胞庫購買。

1.2 分組 將傳代后的人巨噬細胞分組:①對照組;②CSE組（加入1%CSE孵育24 h）;③紅霉素+CSE組（1μg/ml紅霉素預孵育24 h后，加入1%CSE繼續(xù)孵育24 h）;④HDAC特異性抑制劑曲古霉素（TSA）組（加入TSA 100 ng/ml孵育24 h）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 細胞在5%CO2，37℃，以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每周傳代約2次。

1.3.2 應用佛波脂將U937單核細胞系誘導分化成巨噬細胞［7］①將 U937單核細胞重懸，離心（800～1 000 r/min，30～60 s），棄上清液。②加入新的培養(yǎng)基，重懸，計數(shù)。③將細胞均勻地接種到6孔板中，每孔細胞數(shù)為0.5×107～1×107個細胞。④加入佛波脂（10 ng/ml）誘導24 h。⑤24 h后，細胞貼壁，并可見細胞伸出偽足，提示單核細胞經(jīng)誘導分化成巨噬細胞，丟棄上清液，加入新的培養(yǎng)基。

1.3.3 香煙煙霧提取物（CSE）的制作 ①參照以往CSE的制作方法及Se-Ran的香煙煙霧提取物的改良制作方法［8-10］，將2支去過濾嘴香煙（甲天下牌香煙，長度84 mm，焦油含量:15 mg，煙堿含量:1.1 mg）燃燒完全后所產(chǎn)生的香煙煙霧由注射器驅(qū)動裝置連續(xù)抽吸，將煙霧緩慢通入20 m l無血清的培養(yǎng)基中，制成懸液，密封瓶內(nèi)，搖動使其充分溶解，得到10%濃度的CSE溶液，其濃度計算為煤焦油含量1 500 mg/L和煙堿含量110 mg/L。②將溶液的pH值調(diào)至7.4。③用0.22μm濾膜過濾溶液。④溶液于1 h內(nèi)用于實驗，稀釋到需要的濃度后加入細胞。

1.3.4 TNF-α檢測 按照ELISA試劑盒內(nèi)說明書進行。

1.3.5 HDAC總活性測定 ①核蛋白提取，收集:按照核蛋白提取試劑盒（Pierce公司）說明進行。②核蛋白濃度檢測:按照Pierce公司BCA蛋白檢測試劑盒進行。③HDAC活性測定:按照試劑盒（Santa Crus公司）實驗說明進行測定。

1.3.6 HDAC3和NF-κB蛋白表達水平測定 應用蛋白印跡實驗（Western blot）檢測HDAC3和NF-κB蛋白表達。4℃ 0.01 mol/L PBS單洗細胞3次，加300μl蛋白裂解液，裂解產(chǎn)物在冰上繼續(xù)裂解30 min后4℃、12 000 r/min離心10 min。取上清測蛋白濃度及調(diào)整蛋白濃度，至3μg/μl，SDS-PAGE蛋白緩沖液按照比例混合，煮沸5min，立即放入冰箱，4℃、12 000 r/min離心 10 min，取上清，分裝，放 -20℃?zhèn)溆?。制?0%SDS-PAGE膠，4℃保存過夜，恢復至室溫使用，上樣進行垂直電泳，用10%SDSPAGE膠分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，PVDF膜用含有5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h后，用TBST溶液平衡5 min，再與相應一抗（1∶1 000）在4℃共搖床孵育過夜，PVDF膜用TBST洗4次，每次5 min，加相應二抗（1∶5 000）在室溫共搖床孵育1 h，再用TBST洗4次，每次5 min。在暗房內(nèi)用發(fā)光劑發(fā)光，顯影，定影，分析。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)用x-±s表示，兩組間比較采用成組計量資料t檢驗，多組間比較采用方差分析（ANOVA分析），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CSE刺激對人巨噬細胞HDAC總活性的影響與對照組比較，CSE可以明顯抑制HDAC總活性（P＜0.05），紅霉素預孵育24 h稍減輕 CSE對HDAC總活性的抑制作用，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。作為陰性對照組，HDAC的特異性抑制劑TSA組的HDAC總活性被抑制（P＜0.05），見圖1。

2.2 紅霉素對CSE刺激的人巨噬細胞HDAC3蛋白表達的影響 與對照組比較，CSE可以明顯抑制HDAC3蛋白表達，紅霉素預孵育24 h能明顯減輕CSE對HDAC1蛋白表達的抑制作用。作為陰性對照組，HDAC的特異性抑制劑TSA組的HDAC3表達明顯被抑制（P＜0.05），見圖2A、B。

2.3 紅霉素對CSE刺激的人巨噬細胞NF-κB蛋白表達的影響及HDAC特異性抑制劑TSA對NF-κB蛋白表達的影響 與對照組比較，CSE可以明顯增強NF-κB的蛋白表達，紅霉素預孵育24 h可抑制CSE對NF-κB蛋白表達的上調(diào)作用;同時，HDAC特異性抑制劑TSA可以增強 NF-κB的蛋白表達（P＜0.05），見圖3A、B。

圖2 紅霉素對香煙煙霧刺激的人巨噬細胞HDAC3蛋白表達影響Fig.2 Effect of EM on CSE-induced HDAC3 protein expression in human macrophages

圖3 紅霉素對香煙煙霧刺激的人巨噬細胞NF-КB蛋白表達影響Fig.3 Effects of EM on CSE-induced NF-κB protein expression in human macrophages

圖1 紅霉素對香煙煙霧刺激的人巨噬細胞HDAC總活性的影響Fig.1 Effect of EM on CSE-induced change in histone deacetylase（HDAC）activity in human macrophages

圖4 紅霉素對香煙煙霧刺激的人巨噬細胞釋放TNF-α的影響Fig.4 Effect of EM on CSE-induced TNF-α protein release in human macrophages

2.4 紅霉素對CSE刺激的人巨噬細胞釋放TNF-α的影響 與對照組比較，CSE組細胞上清中的TNF-α含量明顯增高（P＜0.05），紅霉素預孵育24 h能明顯抑制 CSE對細胞 TNF-α的上調(diào)作用（P＜0.05），見圖4。

3 討論

組蛋白乙?；福℉AT）和組蛋白去乙酰化酶（HDAC）是調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的酶，因此影響炎癥基因的表達［11，12］。具有內(nèi)源性組蛋白乙?；富钚缘暮诵慕M蛋白的乙酰化導致染色質(zhì)解旋致轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶II結(jié)合到DNA上，促進基因轉(zhuǎn)錄。增強的組蛋白的乙?；梢约訌娧装Y基因的表達。核心組蛋白的去乙?；ǔＥc轉(zhuǎn)錄抑制相關［11，13］。HDACs可以抑制組蛋白的乙?；琀DAC從組蛋白賴氨酸殘基上轉(zhuǎn)移乙?；翫NA纏繞、阻礙了基本轉(zhuǎn)錄單位蛋白質(zhì)復合物進入啟動子結(jié)合位點，導致轉(zhuǎn)錄功能受到抑制。HDACs在抑制基因表達以及抑制核心組蛋白的過度乙?；矫嫫鹬匾饔茫?4］。HDACs家族包含四個組 18 亞型［15］。I型（HDAC1，2，3，8，11）已被證明在調(diào)控細胞增殖和炎癥反應中起重要作用，HDAC3是HDACs中的一個重要亞型，可通過組蛋白去乙?；饔茫{(diào)控染色質(zhì)重構(gòu)和炎癥基因的表達［15］。

最近有研究報道，香煙煙霧引起HDAC表達下降［10，16］，香煙煙霧降低 HDAC1，2，3 蛋白表達水平［10］，因此影響炎癥基因的表達［17］。在這項研究中，我們觀察到香煙煙霧引起人巨噬細胞HDAC總活性下降的同時，HDAC3蛋白表達明顯下降，提示HDAC3在香煙煙霧所誘導的炎癥機制中起重要作用。本研究同時顯示，紅霉素明顯減輕香煙煙霧引起人巨噬細胞HDAC3蛋白表達下降，提示紅霉素能夠活化HDAC3，顯著增加HDAC3蛋白的表達含量，這提示為紅霉素具有對抗香煙煙霧誘導氧化應激所導致的炎癥的分子學作用機制之一;此外，實驗結(jié)果提示紅霉素可提高HDAC總活性，但無統(tǒng)計學意義，可能與樣本量小有關。

研究結(jié)果進一步顯示，香煙煙霧引起巨噬細胞HDAC3蛋白表達下降的同時，誘導增強NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性和蛋白表達，釋放TNF-α增多;HDAC特異性抑制劑TSA抑制HDAC總活性和HDAC3蛋白表達的同時，促使 NF-κB蛋白表達增強，提示HDAC3調(diào)控NF-κB表達，香煙煙霧通過抑制HDAC總活性和HDAC3蛋白表達，誘導增強NF-κB蛋白表達，促進巨噬細胞釋放炎癥介質(zhì)TNF-α，從而誘導炎癥。既往一些研究支持我們的結(jié)果，HDAC1，2，3通過直接或間接改變核轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB的活性從而在調(diào)節(jié)炎癥反應中發(fā)揮重要作用［15］。實驗結(jié)果同時顯示紅霉素不僅可增加HDAC3蛋白表達，并且抑制香煙煙霧誘導增強的 NF-кB活性，抑制TNF-α釋放，提示紅霉素通過增加HDAC3蛋白的表達含量，進而抑制香煙煙霧誘導增強的NF-κB活性和 TNF-α釋放，從而對抗香煙煙霧所誘導的炎癥。

綜上所述，香煙煙霧引起炎癥介質(zhì)的釋放，與HDAC3的調(diào)控有關。紅霉素可抑制香煙煙霧誘導的炎癥，主要與紅霉素活化HDAC3，進而抑制炎癥介質(zhì)合成和釋放相關，實驗結(jié)果為紅霉素治療與吸煙密切相關的氣道慢性炎癥性疾病如慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病、吸煙的支氣管哮喘患者等提供了實驗依據(jù)。

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［收稿2013-09-25 修回2014-01-08］

（編輯 許四平）

Effect of erythrom ycin on cigarette smoke-induced histone deacetylase-3 protein expression in human macrophages

LIMei-Hua，ZHONGXiao-Ning，WENMing-Zhi，HEZhi-Yi，PENGXin-Yan.DepartmentofRespiratoryMedicine，theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China

Objective:To study the effect of erythromycin（EM）on cigarette smoke-induced histone deacetylase-3（HDAC3）protein expression in human macrophages in vitro.Methods:The Aqueous cigarette smoke extract（CSE）was always prepared fresh on the day of the experiment.The U937 monocytic cellswere differentiated intomacrophages by using phorbol12-myristate 13-acetate（PMA）according to standard procedures.The U937 differentiated cells were treated with either CSE（1%）or EM（1 μg/ml）pretreatment，and HDAC inhibitor trichostatin A（TSA;100 ng/ml）for 24 h.HDAC activity wasmeasured with a colorimetric assay kit and Western blotwas used for HDAC3 and factor nuclear-kappaB（NF-κB）protein assays.The levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α）release in the supernatantwere determined by enzyme linked immunosorbentassay（ELISA）.Results:CSE（1%）significantly decreased HDAC activity and HDAC 3 protein levels at24 h.Preincubation with EM（1μg/ml）for 24 h significantly inhibit CSE（1%）induced decrease of HDAC3 protein expression.Furthermore，Preincubation with EM（1 μg/ml）for 24 h significantly inhibit NF-κB activity and TNF-α release in humanmacrophages.Conclusion:EM is able to restore HDAC3 levels decreased by cigarette smoke and inhibit NF-κB activity resulting in decreasing CSE-mediated TNF-α release，which has shown an importantexplanation that EM possess the anti-inflammatory effect induced by cigarette smoke.

Erythromycin;histone deacetylase 3;Cigarette smoke

R965

A

1000-484X（2014）05-0600-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.006

①本文為國家自然科學基金資助項目（No.30760085）、國家自然科學基金資助項目（No.81360012）及廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費科研課題（No.Z2012076）。

李梅華（1975年-），女，博士，副教授，碩士生導師，主要從事慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病機制及防治研究。

及指導教師:鐘小寧（1959年-），男，博士，教授，博士生導師，主要從事慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病機制及防治研究。