劉 娟，郝春艷，李鳳偉

(佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007)

柳蘭(Chamaenerion angustifoliu)為柳葉菜科柳蘭屬多年生草本植物[1，2]，異名糯芋(云南)、大救駕(湖北) 、山麻條(四川) ，又名紅筷子。柳蘭全草入藥，性辛、苦、平，有小毒，具有調(diào)經(jīng)活血及消腫止痛的功效，用于治療骨折、關(guān)節(jié)扭傷、月經(jīng)不調(diào)、陰囊腫大等癥[3]。目前已經(jīng)從柳蘭中分離出了4個黃酮類化合物和9個鞣質(zhì)及其小分子多元酚類化合物[4，5]。其提取物具有抗腫瘤和抗炎作用[6，7]。鞣質(zhì)也稱單寧，是一類水溶性的含多酚羥基結(jié)構(gòu)的化合物，其具有較強的化學活性及生理活性，如抗氧化、抗病毒、抗衰老、止血作用等[8]。通過對相關(guān)文獻的查閱，目前尚未見有對其鞣質(zhì)含量測定及其所含化學成分鞣質(zhì)的體外抗氧化活性的相關(guān)報道，因此本文以柳蘭鞣質(zhì)含量變化為指標，采用紫外分光光度法測定了不同生長期柳蘭中鞣質(zhì)的含量，研究柳蘭中鞣質(zhì)的動態(tài)積累規(guī)律，并測定其鞣質(zhì)成分的體外抗氧化活性，為柳蘭的開發(fā)利用及藥材采收加工提供科學依據(jù)。

1 材料、儀器與試劑

1.1 試驗材料

柳蘭樣品分別于2013年5～8月采自黑龍江省佳木斯市湯原縣葫蘆島，經(jīng)佳木斯大學生藥學教研室劉娟教授鑒定為柳葉菜科植物柳蘭(Chamaenerion angustifoliu)。

1.2 試驗儀器

紫外分光光度計 (上海棱光技術(shù)有限公司)，電子天平(上海恒平科學儀器有限公司)，HH - 2.4型恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，微型植物粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.3 試驗試劑

沒食子酸標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號：0831-9501)；DPPH標準品(Sigma公司)；鄰苯三酚、丙酮、鉬酸鈉、硫酸鋰、鎢酸鈉、鹽酸、溴、磷酸均為分析純。干酪素為化學純。

2 方法與結(jié)果

2.1 柳蘭鞣質(zhì)的含量測定

2.1.1 溶液的配制

磷鉬鎢酸試液的配制：稱取鉬酸鈉25g、鎢酸鈉100g，加入水700mL將其溶解，再加入磷酸50mL、鹽酸100mL，加熱回流10h，冷卻，繼續(xù)加入硫酸鋰150g、水50mL和液溴0.2mL，加熱煮沸約15min以除去殘留的溴，用水稀釋至1000mL，過濾，收集濾液，即得黃色磷鉬鎢酸試液。對照品溶液的制備：準確稱取沒食子酸對照品50mg，置于100mL棕色容量瓶中，加水溶解，稀釋至刻度，準確量取上述溶液5mL，置于50mL棕色容量瓶中，以水稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.05mg/mL的對照品溶液。

供試品溶液的制備：精密稱取過四號篩的柳蘭干燥全草粉末1g于三頸瓶中，以60%丙酮為溶劑，料液比為1:20，70℃水浴回流2h，濾過，定容于25mL容量瓶中，從中精密量取5mL定容于100mL容量瓶中，即為供試品溶液。

2.1.2 標準曲線的繪制

準確移取沒食子酸對照品溶液0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL，分別置于25mL棕色容量瓶中，再各加入磷鉬鎢酸試液1mL，分別加入水11.5mL、11mL、10mL、9mL、8mL、7mL，以29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，避光靜置30min。以相應的試劑作為空白，照紫外可見分光光度法，在760nm波長處測定吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：y=101.7x+0.022。

圖1 沒食子酸標準曲線

2.1.3 含量測定條件的選擇

顯色時間：根據(jù)2010年版《中國藥典》方法，樣品溶液中加入顯色劑靜置30min后，其中的酚酸可與顯色劑完全反應，經(jīng)穩(wěn)定性考察表明，溶液顯色后在3 h內(nèi)穩(wěn)定。因此選擇顯色時間為30 min，并且在3 h內(nèi)測定吸光度。

干酪素用量：分別準確稱取0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9g干酪素，沉淀等量的樣品(供試品溶液25mL)。結(jié)果表明，隨著干酪素用量的增加，游離多酚的含量逐漸減少，當干酪素用量達0.8g時，溶液中的游離多酚含量不再減少，說明其中的鞣質(zhì)已被干酪素吸附完全。由此確定干酪素用量為0.8g。

2.1.4 鞣質(zhì)含量測定方法

總酚：精密吸取一定量的供試品溶液，置于25mL棕色容量瓶中，按照標準曲線的制備項下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1mL”起，再加水補至13mL，以29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度。依法測定溶液吸光度，在標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)，計算即得。

不被吸附的多酚：準確量取供試品溶液25mL，加于已盛有干酪素0.8g的100mL具塞錐形瓶中，密封，置于30℃水浴中，保溫1h，每隔5min振搖一次，取出放冷，搖勻，過濾，棄去初濾液，準確量取續(xù)濾液5mL，置于25mL棕色容量瓶中，按照標準曲線制備項下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1mL”起，再加水補至13mL，以29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度。依法測定吸光度，在標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)，計算即得。

按照下式計算鞣質(zhì)的含量：

鞣質(zhì)含量=總酚的量-不被吸附的多酚量

2.1.5 方法學考察

精密度試驗：準確移取供試品溶液1mL，按照總多酚含量測定的方法，測定樣品的吸光度，連續(xù)測定6次，RSD為0.19%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性考察：準確移取同一供試品溶液1mL，按照總多酚含量測定方法進行顯色，分別在顯色后0.5，1，1.5，2，2.5，3 h測定溶液的吸光度。結(jié)果表明，隨著顯色后放置時間的延長，樣品溶液的吸光度在逐漸的下降，但在3 h內(nèi)溶液吸光度的RSD為2.6%(n=6)，表明樣品顯色后至少在3h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性考察：取6份同一柳蘭樣品粉末1g，平行制備供試品溶液6份，按“2.1.4”項下方法測定鞣質(zhì)含量，結(jié)果鞣質(zhì)含量平均為12.07%，RSD為2.3%，結(jié)果表明此方法重復性良好。加樣回收率考察：取同一柳蘭樣品粉末9份，每份1g，精密稱定，平行制備供試品溶液，分別加入一定量的沒食子酸對照品溶液，使得沒食子酸的加入量為柳蘭樣品中總多酚含量的50%(3份)、100%(3份)和150%(3份)。按照總多酚含量的測定方法測定樣品中總多酚含量，計算其加樣回收率，結(jié)果其平均加樣回收率為99.03%，RSD為2.55%。

2.1.6 柳蘭樣品含量測定

取不同采收時期柳蘭全草干燥粉末各1g，供制備試品溶液，準確移取供試品溶液1mL，在“2.1.4”項條件下顯色，測定其吸光度，每個樣品平行測定兩次，取平均值，計算鞣質(zhì)含量。

表1 不同采收期柳蘭中鞣質(zhì)的含量測定(%，n=2)

研究結(jié)果表明柳蘭中鞣質(zhì)含量隨著生長期不同呈規(guī)律性變化，不同時期柳蘭中鞣質(zhì)含量由高到低依次為：花蕾期>花果期>幼苗期>果期。

2.2 柳蘭鞣質(zhì)的純化

取提取液適量，加入過量1%熱明膠溶液，使其充分沉淀，直至沉淀不再產(chǎn)生為止，過濾，將沉淀置于丙酮中，過濾，減壓回收溶劑至干，即得柳蘭鞣質(zhì)提取物粉末。

2.3 柳蘭鞣質(zhì)體外抗氧化活性評價

2.3.1 對DPPH自由基的清除作用

分別取不同濃度(0.002、0.004、0.006、0.008、0.01mg/mL)的柳蘭鞣質(zhì)溶液2.0mL于試管中，分別加入DPPH溶液2.0mL，于37℃避光反應30min，在517nm波長處測定其吸光度值(AS)。同時，在517nm處測定不同濃度樣品2.0mL加乙醇2.0mL的吸光度值(AC)，乙醇2.0mL 加DPPH 2.0mL的吸光度值(A0)。并計算DPPH自由基清除率。以Vc溶液作為陽性對照。其清除率按下式計算：

清除率(%)=[1-(AS-AC)]/A0×100%

圖2 柳蘭鞣質(zhì)對DPPH的清除能力

圖3 Vc對DPPH的清除能力

維生素C和柳蘭鞣質(zhì)對DPPH自由基均有清除作用，隨著濃度升高，清除率增大，其IC50值分別為0.00502mg/L和0.00632mg/mL，二者較為接近，表明柳蘭鞣質(zhì)具有較好的清除DPPH自由基的作用。

2.3.2 對超氧陰離子自由基的清除作用

在試管中準確加入5mL Tris-HC1緩沖溶液(pH=8.2)和2.0mL不同濃度的樣品(0.008mg/mL，0.016mg/mL，0.024mg/mL，0.032mg/mL，0.04mg/mL)，混勻后在25℃恒溫水浴中反應20min，取出后迅速加入50μL經(jīng)25℃預熱的5mmol/L的鄰苯三酚，搖勻后立即倒入比色皿中，于325nm處以30s為時間間隔，掃描其在5min內(nèi)的OD值。以同樣操作的2.0mL超純水代替樣品溶液作為平行對照，以同樣操作的Vc溶液作為陽性對照組，以pH=8.2的Tris-HC1緩沖溶液為空白對照。根據(jù)鄰苯三酚每分鐘自氧化率計算抑制率，按照下列公式計算：

抑制率(%)=(ΔA0/Δt-ΔA1/Δt)/(ΔA0/Δt)

ΔA0/Δt—平行對照組鄰苯三酚在該時段的自氧化率；

ΔA1/Δt—加入樣品后鄰苯三酚在該時段的自氧化率；

由圖可知，維生素C和柳蘭鞣質(zhì)對超氧陰離子自由基清除作用均隨著濃度的增加而增強，其IC50值分別為0.01mg/mL和0.028mg/mL，說明柳蘭鞣質(zhì)具有一定抗超氧陰離子自由基的活性，但較維生素C弱。

圖4 柳蘭鞣質(zhì)對超氧陰離子自由基的清除作用

圖5 Vc對超氧陰離子自由基的清除作用

3 討論

采用紫外分光光度法測定柳蘭鞣質(zhì)，經(jīng)過方法學的驗證，其試驗穩(wěn)定性、儀器精密度、加樣回收率及方法重現(xiàn)性均達到分析要求，且該方法簡便快捷，準確性高，操作簡單、省時、取樣量少，適用于柳蘭鞣質(zhì)的含量測定。但其干酪素用量對實驗結(jié)果具有一定影響，因此本實驗對干酪素用量進行了考察，將其可吸附多酚完全吸附，確保了結(jié)果的準確性。研究結(jié)果顯示柳蘭中鞣質(zhì)含量隨著生長期不同呈規(guī)律性變化，在花蕾期含量最高，含量為12.50%，果期含量最低，含量為5.32%，這可能是由于其生長環(huán)境、陽光、溫度、降水量等條件的改變所致。該結(jié)果表明，若以鞣質(zhì)作為其有效成分之一，柳蘭藥材的最佳采收期為花蕾期。

本實驗通過對柳蘭鞣質(zhì)體外抗氧化活性的研究，表明柳蘭鞣質(zhì)對于DPPH自由基和超氧陰離子自由基均具有一定的清除作用。表明柳蘭在醫(yī)藥、保健品等行業(yè)的應用具有遠大前景。

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