宋添添牟 瑛張桂英

（1解放軍302醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，北京，100039；2吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，長(zhǎng)春，130021）

白樺脂醇的體內(nèi)抗腫瘤作用及機(jī)制

宋添添1牟 瑛1張桂英2

（1解放軍302醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，北京，100039；2吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，長(zhǎng)春，130021）

目的：研究白樺酯醇的體內(nèi)抗腫瘤作用及機(jī)制。方法：采用小鼠肝癌細(xì)胞（H22）建立荷瘤小鼠動(dòng)物模型，白樺脂醇灌胃10 d后，計(jì)算抑瘤率、胸腺指數(shù)、脾指數(shù)；MTT法測(cè)定小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能及NK細(xì)胞殺傷活性。結(jié)果：白樺脂醇三個(gè)劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組瘤重均減輕，與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中劑量組抑瘤率最高；三個(gè)劑量組脾指數(shù)與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中、高劑量組與陰性對(duì)照組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中劑量組胸腺指數(shù)與陰性、陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中劑量組T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率與陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量組在效靶比為25∶1時(shí)，NK細(xì)胞殺傷活性高于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），在效靶比為100∶1，殺傷活性高于陰性對(duì)照組（P＜0.05）；中劑量組在效靶比為25∶1、50∶1、100∶1時(shí)，NK細(xì)胞殺傷活性均同時(shí)高于陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05）；高劑量組在效靶比為25∶1時(shí)，NK細(xì)胞殺傷活性高于陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論：白樺脂醇通過(guò)刺激激活免疫器官，提高T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能、提高NK細(xì)胞殺傷活性來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

白樺脂醇；抑瘤效應(yīng)；MTT；小鼠；免疫細(xì)胞

用于治療腫瘤的天然藥物存在選擇性低、毒性大及耐藥等問(wèn)題。從天然植物中尋找新的抗腫瘤藥物已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。白樺脂醇是從樺樹(shù)皮中提取的三萜類化合物，具有殺菌、抗病毒、防紫外線、消炎、快速治愈傷口、抗過(guò)敏等作用，還可改善受損頭發(fā)光澤，促進(jìn)頭發(fā)生長(zhǎng)，在食品，醫(yī)藥，日用化工等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[1－5]，是非常有價(jià)值的天然物質(zhì)，可以從豐富的植物資源中獲得。本研究通過(guò)荷瘤小鼠探討白樺酯醇的抗腫瘤的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株 雄性昆明種小鼠50只，體重（18～20 g），由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供；小鼠肝癌細(xì)胞（H22），由吉林大學(xué)公衛(wèi)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室提供，人髓樣白血病細(xì)胞（K562），由302醫(yī)院艾滋病研究室。

1.2 藥物及主要試劑 白樺脂醇純品從上海升佳公司購(gòu)得，呈白色粉末狀，含量99%，用橄欖油配成濃度為1 mg·mL－1、2 mg·mL－1、4 mg·mL－1的溶液，4℃保存。用于體內(nèi)陽(yáng)性對(duì)照的環(huán)磷酰胺用生理鹽水配成濃度為2.5 mg·mL－1的溶液，4℃保存。DMSO（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司），MTT（AMRESCO公司），小牛血清（FCS，大連生物試劑廠），RPMT－1640、IMDM培養(yǎng)液（GIBCO公司），刀豆凝集素（ConA，美國(guó)Sigma公司），IL－2（吉林大學(xué)第一醫(yī)院）。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 50只雄性昆明種小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d，取0.2 mL濃度為1×107·mL－1的H22細(xì)胞接種至小鼠左下肢腹股溝皮下，4 d后可觸及小米粒大小實(shí)體瘤。將小鼠隨機(jī)分為5組：陰性對(duì)照組（NC）、陽(yáng)性對(duì)照組（PC）、低劑量組（LD）、中劑量組（MD）、高劑量組（HD），每組10只。陰性對(duì)照組按0.1 mL·10 g－1體重灌胃橄欖油；陽(yáng)性對(duì)照組按25 mg ·kg－1灌胃環(huán)磷酰胺；低劑量組、中劑量組、高劑量組分別按10 mg·kg－1、20 mg·kg－1、40 mg·kg－1灌胃相應(yīng)濃度的白樺脂醇橄欖油溶液。連續(xù)灌胃10 d，第11 d拉頸處死。

1.3.2 白樺脂醇對(duì)荷瘤小鼠抑瘤率的影響 小鼠處死后取腫瘤稱重，計(jì)算抑瘤率。

1.3.3 白樺脂醇對(duì)荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響 小鼠處死后無(wú)菌條件下取脾、胸腺稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)（g/100 g）＝（臟器重/體重）×100。

1.3.4 白樺脂醇對(duì)荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響 無(wú)菌條件下取小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度至1×107·mL－1，加FCS使血清濃度達(dá)10%，取96孔培養(yǎng)板，每只小鼠設(shè)：1）對(duì)照孔，每孔加入100 μL IMDM培養(yǎng)液；2）ConA刺激孔，每孔加入10μg· mL－1ConA液100μL，各3復(fù)孔，然后每孔加入100μL小鼠脾細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板移入CO2孵箱孵育44 h，各孔加入MTT溶液10μL，繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)上清，每孔加入DMSO 100μL，震蕩10 min。酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值。

1.3.5 白樺脂醇對(duì)荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響 靶細(xì)胞制備需用1640培養(yǎng)液調(diào)K562細(xì)胞濃度至2×105·mL－1，加入FCS使血清濃度達(dá)10%；效應(yīng)細(xì)胞制備需取淋轉(zhuǎn)所用濃度為1×107·mL－1的脾細(xì)胞懸液，用10%FCS－IMDM調(diào)至5×106·mL－1和2.5× 106·mL－1；取靶細(xì)胞懸液50μL和效應(yīng)細(xì)胞懸液100 μL加入96孔培養(yǎng)板，效靶比分別為100∶1、50∶1、25∶1，空白對(duì)照組加靶細(xì)胞懸液50μL和完全培養(yǎng)液100μL，效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組加相應(yīng)濃度的脾細(xì)胞懸液200 μL；每個(gè)樣品3復(fù)孔。將培養(yǎng)板移入CO2孵箱孵育20 h，每孔吸出上清液100μL，補(bǔ)充無(wú)血清1640培養(yǎng)液100μL，MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h終止培養(yǎng)，每孔吸出上清120μL，加入DMSO 150μL，震蕩，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值。

A：靶細(xì)胞加效應(yīng)細(xì)胞混合培養(yǎng)孔OD值；B：效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔OD值；C：空白對(duì)照孔OD值

2 結(jié)果

2.1 白樺脂醇對(duì)荷瘤小鼠抑瘤率的影響 白樺脂醇三個(gè)劑量組小鼠瘤重均減輕，與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中中劑量組抑瘤率最高。見(jiàn)表1。

表1 白樺脂醇對(duì)荷瘤小鼠抑瘤率的影響（g，±s）

表1 白樺脂醇對(duì)荷瘤小鼠抑瘤率的影響（g，±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05。

組別例數(shù)瘤重抑制率（%）52.03 NC 10 1.14±0.28－LD 10 0.69±0.21*39.60 MD 10 0.56±0.15*51.31 HD 10 0.73±0.20*36.04 PC 10 0.55±0.17*

2.2 白樺脂醇對(duì)荷瘤小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響白樺脂醇各劑量組與陰性、陽(yáng)性對(duì)照組比較，脾指數(shù)均升高，與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中、高劑量組與陰性對(duì)照組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中劑量組與陰性、陽(yáng)性對(duì)照組比較，胸腺指數(shù)升高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 白樺脂醇對(duì)荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響 白樺脂醇低、中劑量組與陰性對(duì)照組比較，T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率有所上升，陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率有所下降，中劑量組與陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表2 白樺脂醇對(duì)荷瘤小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響（g/100 g，±s）

表2 白樺脂醇對(duì)荷瘤小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響（g/100 g，±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與PC組比較，△P＜0.05。

Group 例數(shù)脾指數(shù)胸腺指數(shù)NC 10 0.66±0.15 0.13±0.02 LD 10 0.75±0.20△0.15±0.02 MD 10 0.85±0.17*△0.18±0.05*△HD 10 0.94±0.20*△0.16±0.09 PC 10 0.54±0.13 0.13±0.04

表3 白樺脂醇對(duì)荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響（±s）

表3 白樺脂醇對(duì)荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響（±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與PC組比較，△P＜0.05。

組別例數(shù)SI NC 10 1.15±0.19 LD 10 1.25±0.10 MD 10 1.52±0.21*△HD 10 1.14±0.08 PC 10 1.04±0.09

2.4 白樺脂醇對(duì)荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響

當(dāng)效靶比為25∶1時(shí)，白樺脂醇三個(gè)劑量組小鼠NK細(xì)胞殺傷活性均高于陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中、高劑量組與陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；效靶比為50∶1時(shí)，中劑量組NK細(xì)胞殺傷活性最高，為32.4%，與陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；效靶比為100∶1時(shí)，低、中劑量組NK細(xì)胞殺傷活性與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 白樺脂醇對(duì)荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響（±s）

表4 白樺脂醇對(duì)荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響（±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與PC組比較，△P＜0.05。

組別例數(shù)NK細(xì)胞殺傷活性（%）25∶1 50∶1 100∶1 NC 10 19.0±1.9 17.8±1.6 17.9±1.3 LD 10 22.1±2.6△21.7±2.5 23.2±2.7*MD 10 29.9±1.4*△32.4±3.0*△26.3±2.5*△HD 10 24.9±2.4*△17.0±2.3 18.7±3.1 PC 10 17.3±1.7 17.7±2.7 19.2±1.4

3 討論

三萜類化合物中的白樺脂酸有抗炎、抗腫瘤，抗人類免疫缺陷病毒（HIV）等作用[6－13]，可由白樺脂醇經(jīng)兩步反應(yīng)得到[14－16]。蔡唯佳等[17]研究發(fā)現(xiàn)白樺脂醇對(duì)體外培養(yǎng)的食管癌細(xì)胞有抑制作用。本研究結(jié)果表明，白樺脂醇各劑量組與陰性對(duì)照組比較，瘤重均減輕（P＜0.05），特別是中劑量組，抑瘤率達(dá)51.31%，接近陽(yáng)性對(duì)照組的抑瘤率，說(shuō)明白樺脂醇可較好地抑制腫瘤生長(zhǎng)。

有研究認(rèn)為，白樺脂酸能夠提高T細(xì)胞增殖力，增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，提高INF水平，抑瘤機(jī)制可能與直接或間接增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫有關(guān)[18－19]。脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的增大反映了脾、胸腺重量的增加，因此用脾指數(shù)和胸腺指數(shù)評(píng)價(jià)白樺脂醇對(duì)荷瘤小鼠免疫器官的影響。本研究結(jié)果表明，中劑量組白樺脂醇的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)同時(shí)高于陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），低劑量組脾指數(shù)高于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05）；高劑量組脾指數(shù)高于陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），陽(yáng)性對(duì)照組脾指數(shù)較陰性對(duì)照組低。說(shuō)明白樺脂醇對(duì)小鼠免疫器官有一定的刺激激活作用，其中中劑量組作用最強(qiáng)。T淋巴細(xì)胞是重要的免疫活性細(xì)胞，主要發(fā)揮細(xì)胞免疫作用，并協(xié)助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，釋放淋巴因子參與免疫調(diào)節(jié)，在抗感染、抗腫瘤、免疫監(jiān)視方面發(fā)揮重要作用。在特異性或非特異性抗原如ConA、PHA等的誘導(dǎo)下，T淋巴細(xì)胞可發(fā)生轉(zhuǎn)化、增殖，故T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能反映了機(jī)體的免疫狀況[20－21]。本研究結(jié)果表明：低、中劑量組與陰性對(duì)照組比較，T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率有所上升，陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率下降，中劑量組與陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明中劑量白樺脂醇可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。NK細(xì)胞主要發(fā)揮免疫監(jiān)視和抗腫瘤作用[20－21]，能夠調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞的分化并分泌IL－1、IL－2、INF－α和INF－γ等。NK細(xì)胞殺傷活性可反應(yīng)機(jī)體的免疫功能。本研究結(jié)果表明，低劑量組在效靶比為25∶1時(shí)，NK細(xì)胞殺傷活性高于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），在效靶比為100∶1，殺傷活性高于陰性對(duì)照組（P＜0.05）；中劑量組在效靶比為25∶1、50∶1、100∶1時(shí)，NK細(xì)胞殺傷活性同時(shí)高于陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05）；高劑量組在效靶比為25∶1時(shí)，NK細(xì)胞殺傷活性高于陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05）。說(shuō)明白樺脂醇可以提高NK細(xì)胞殺傷活性，增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能，中劑量組作用最強(qiáng)，在效靶比為25∶1時(shí)，殺傷活性最高。而白樺脂醇提高機(jī)體非特異性免疫功能是如何在分子水平上發(fā)揮作用的，有待進(jìn)一步研究。

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（2013－12－11收稿 責(zé)任編輯：曹柏）

Anti-tumor Effects of Betulin and Its M echanism in Vivo

Song Tiantian1，Mu Ying1，Zhang Guiying2
（1 Department of Nutrition，302 Hospital of PLA，Beijing 100039，China；2 Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health，Jilin University，Changchun 130021，China）

Objective：To investigate the anti-tumor activity of betulin in vivo and it'smechanism.Methods：The study built tumor bearingmicemodel by injecting H22 tumor cells on themice＇s left inguinal region.Themicewere given intragastric administration of betulin for ten days.Inhibition ratio，thymus index and spleen index were calculated after that.Then betulin＇s effects on T lymphocyte transformation，NK activity were detected using MTTmethod.Results：Tumorweight of three betulin groups and positive control group decreased compared with that of negative control group（P＜0.05），especially that of themiddle dose group.Spleen index in betulin group had significant difference compared with positive control group（P＜0.05）.Middle dose and high dose group had significant difference from negative control group（P＜0.05）.Thymous index in middle dose group had significant difference compared with negative control and positive controlgroup（P＜0.05）.Tlymphocyte transformation rate ofm iddle dose group had significant difference compared with negative control and positive control group（P＜0.05）.When effect cell/target cell was 25，NK activity in low dose group was higher than positive control group（P＜0.05），and when effect cell/target cellwas100，itwas higher than negative control group（P＜0.05）；NK activity inmiddle dose group was higher than negative control and positive control group，when effect cell/target cellwas 25 or 50 or 100（P＜0.05）；NK activity in high dose group was higher than negative control and positive control group when effect cell/target cell was25.Conclusion：Betulin can inhibit the proliferation of tumor cell by promoting T lymphocyte transformation and enhancing NK activity.

Betulin；Anti-tumor；MTT；Mice；Immune cells

R285.6

A

10.3969/j.issn.1673－7202.2014.07.025

吉林省科技廳資助項(xiàng)目（編號(hào)：201105020）

宋添添（1985—），碩士，醫(yī)師，本文為作者在讀碩士期間所做部分研究

張桂英（1957—），女，本科，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與疾病控制，E－mail：943769970＠qq.com