李 飛，藺麗慧，王 娟，李 佳，彭 霞，肖 輝，劉亞楠，戴慧蓉，王玉萍，李 莉

過敏性哮喘是一種以肺部嗜酸粒細(xì)胞浸潤、黏液分泌增加和氣道高反應(yīng)性為特征的慢性氣道性疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中Ⅰ型超敏反應(yīng)被認(rèn)為是其主要機(jī)制，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞參與此過程，如樹突細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞以及肥大細(xì)胞[1]。樹突細(xì)胞是來自骨髓的一群異質(zhì)細(xì)胞，分布于大多數(shù)外周組織中。位于鼻、氣管、支氣管、肺泡和臟層胸膜在內(nèi)的整個(gè)肺組織的樹突細(xì)胞能主動(dòng)捕獲、加工處理外來抗原，并由主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子(MHCⅡ)完成抗原提呈，一旦其進(jìn)入發(fā)育成熟階段即失去這種捕獲能力；與此同時(shí)進(jìn)入成熟階段的樹突細(xì)胞在形態(tài)和功能方面發(fā)生巨大變化，其表面MHC、協(xié)同刺激分子和黏附分子表達(dá)增多，導(dǎo)致樹突細(xì)胞激活T細(xì)胞的能力增強(qiáng)，進(jìn)而引起免疫應(yīng)答[2]。樹突細(xì)胞作為目前已知的體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞在此過程中占據(jù)關(guān)鍵地位[3]。

此前對于哮喘的研究多集中在Th1/Th2平衡和肥大細(xì)胞脫顆粒等方面[4]，但對于樹突細(xì)胞在過敏性哮喘發(fā)病中所發(fā)揮的作用卻少有報(bào)道。有研究表明哮喘患者外周血中樹突細(xì)胞的比例和絕對數(shù)量均有不同程度的升高[5]。本實(shí)驗(yàn)擬通過尾靜脈注射樹突細(xì)胞,然后致敏和激發(fā)，觀察小鼠的生命狀態(tài)、脾臟的增生情況、肺泡灌洗液中的組胺水平、肺組織炎性反應(yīng)情況，進(jìn)一步揭示樹突細(xì)胞在哮喘發(fā)病中發(fā)揮的作用，為哮喘的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器 雄性BALB/c(H-2d)小鼠30只，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，購自上海必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,飼養(yǎng)在SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施中。RPMI 1640全培養(yǎng)液〔含RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)、10%胎牛血清(GIBCO公司)、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素及50 μmol/L 2-巰基乙醇(Amerco公司)〕。紅細(xì)胞裂解液由本室配制。重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)及重組白介素4(rmIL-4，Peprotech公司)，脂多糖(LPS)和二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)，CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit-8，Dojindo公司)。熒光抗體:抗小鼠CD11c抗體，抗小鼠MHC Ⅱ抗體，抗小鼠CD86抗體(Biolegend公司)。流式細(xì)胞儀FC500(Beckman Coulter公司)，倒置顯微鏡(Olympus公司)。恒溫培養(yǎng)箱(SANYO MCO-175)，酶標(biāo)儀(Thermo MK-3)。

1.2 骨髓源性樹突細(xì)胞(BMDC)的培養(yǎng) 無菌取出骨髓細(xì)胞，裂解紅細(xì)胞，用RPMI 1640全培養(yǎng)液配成1×106cell/ml的單細(xì)胞懸液。接種于6孔培養(yǎng)板，每孔5 ml，加入rmGM-CSF(終濃度10 ng/ml)及rmIL-4(終濃度10 ng/ml)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第4天時(shí)吸棄全部培養(yǎng)基，并沿培養(yǎng)板壁緩慢加入3 ml RPMI 1640,緩慢均勻搖晃培養(yǎng)板30 s，吸去培養(yǎng)基，重復(fù)洗滌1次，盡可能清除懸浮細(xì)胞。然后加入等量RPMI 1640全培養(yǎng)液和rmGM-CSF及rmIL-4，第7天輕輕吹打后收獲懸浮細(xì)胞[6]。部分實(shí)驗(yàn)于第6天加入1 μg/ml LPS或者10 μg/ml OVA。

1.3 樹突細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 于倒置顯微鏡下觀察樹突細(xì)胞的形態(tài)。

1.4 樹突細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測 收集培養(yǎng)的細(xì)胞約5×105個(gè)懸于100 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)，加入熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體1 μl，4 ℃避光孵育30 min，離心去上清液，加入2 ml PBS清洗細(xì)胞1次，然后將細(xì)胞重懸于0.5 ml PBS，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD11c、CD86及MHCⅡ表達(dá)情況。

1.5 樹突細(xì)胞回輸及哮喘模型的建立 小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組10只。健康對照組不做任何處理；哮喘組給予PBS，然后致敏和激發(fā)；OVA-DC干預(yù)組尾靜脈注射負(fù)載OVA的樹突細(xì)胞 1×106個(gè),然后致敏和激發(fā)。哮喘組和OVA-DC干預(yù)組第1天給予干預(yù)，第7天、第14天分別腹腔注射0.2 ml OVA和氫氧化鋁〔Al(OH)3〕混懸液〔含20 mg OVA和2 mg Al(OH)3〕,第27、28、29天連續(xù)給予1% OVA混懸液霧化吸入，30 min/次。

1.6 觀察生存狀態(tài) 在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)過程中密切觀察小鼠的呼吸情況、體力活動(dòng)以及生命狀態(tài)。

1.7 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR) 頸椎脫臼法處死小鼠，無菌條件下取出脾臟，制備脾臟單細(xì)胞懸液。裂解紅細(xì)胞，獲得同種異體脾臟細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞。培養(yǎng)獲得的樹突細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮，調(diào)整密度為5×106cell/ml，加入終質(zhì)量濃度為25 ng/ml的絲裂霉素C，37 ℃孵育45 min。PBS清洗后用RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，分別以1.25×103/孔、2.50×103/孔、5.00×103/孔、10.00×104/孔96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔再加入1×105個(gè)同種異體T細(xì)胞，終體積為200 μl，設(shè)單純T細(xì)胞組為對照組，另設(shè)空白組。于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h。各孔加入CCK-8 10 μl，置培養(yǎng)箱4 h，用酶標(biāo)儀測A450值，取3孔的平均值作為結(jié)果，計(jì)算刺激指數(shù)(SI)，SI=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)。

1.8 測定脾臟質(zhì)量 取出小鼠脾臟，觀察脾臟大小，并用計(jì)量器準(zhǔn)確稱量其質(zhì)量。

1.9 肺泡灌洗液組胺水平檢測 霧化后24 h麻醉小鼠，暴露氣管，氣管插管并固定，結(jié)扎右側(cè)主支氣管，用1 ml注射器吸取0.3 ml PBS，接入氣管針，來回反復(fù)抽吸5次，收集灌洗液。重復(fù)灌洗兩次。每只小鼠共用0.9 ml PBS,回收灌洗液置于1只EP管中，混勻，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 肺組織蘇木素-伊紅(HE)染色 取右側(cè)未行肺泡灌洗的肺組織，置于甲醛固定液中固定24 h以上，脫水，石蠟包埋，切片后行HE染色，鏡下觀察并攝影。

2 結(jié)果

2.1 樹突細(xì)胞的形態(tài) 每只小鼠的股骨和脛骨共可分離(1.5～2.0)×107個(gè)骨髓細(xì)胞，培養(yǎng)2 d后，倒置顯微鏡下可見部分細(xì)胞貼壁生長，分布均勻，有細(xì)胞聚集現(xiàn)象，細(xì)胞大小比較一致，呈圓形。第3天時(shí)，可見大量細(xì)胞集落，緊密貼壁，極少數(shù)細(xì)胞從集落周邊脫落，細(xì)胞呈圓形，但可見少數(shù)棘突樣結(jié)構(gòu)突出于細(xì)胞表面，細(xì)胞體積有所增大(見圖1A)。培養(yǎng)第4、5天，細(xì)胞集落繼續(xù)變大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，周邊棘突增多。第6、7天，細(xì)胞不斷從集落上脫落下來，細(xì)胞集落變小，多數(shù)細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，大小不均勻，形態(tài)亦不規(guī)則，周邊布滿指狀突起(見圖1B)。

注：A第3天大量細(xì)胞集落貼壁生長，細(xì)胞呈圓形，大小一致(×100)；B 第6天細(xì)胞集落呈懸浮狀態(tài)，表面可見指狀的細(xì)胞突起(×200)，右下角為樹突細(xì)胞表面情況，可見明顯的樹突狀結(jié)構(gòu)(×400)

圖1 樹突細(xì)胞培養(yǎng)

Figure1 Culture of DCs

2.2 樹突細(xì)胞的免疫表型檢測 流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，細(xì)胞中CD11c的陽性率大于80%，所獲得的樹突細(xì)胞的純度很好，可以用于體內(nèi)回輸。對未經(jīng)處理的樹突細(xì)胞、負(fù)載OVA的樹突細(xì)胞和LPS刺激后的樹突細(xì)胞分別檢測MHCⅡ和CD86表達(dá)情況，結(jié)果顯示未經(jīng)處理的樹突細(xì)胞和負(fù)載OVA的樹突細(xì)胞表達(dá)MHCⅡ和CD86的陽性率低，且表達(dá)水平低；而LPS刺激后的樹突細(xì)胞兩種分子的陽性率增高，且表達(dá)水平提高(見圖2)。

2.3 樹突細(xì)胞刺激MLR檢測 CCK-8檢測MLR顯示，未經(jīng)處理的樹突細(xì)胞和負(fù)載OVA的樹突細(xì)胞刺激淋巴細(xì)胞增殖能力一樣，僅在樹突細(xì)胞:淋巴細(xì)胞為1∶10時(shí)才能刺激淋巴細(xì)胞增殖，但LPS刺激后的樹突細(xì)胞卻能極大地促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖(見圖3)。

圖2 樹突細(xì)胞表面膜分子的表達(dá)

注：SI=刺激指數(shù)

圖3 混合淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

Figure3 Mixed lymphocyte proliferation test

2.4 樹突細(xì)胞回輸后實(shí)驗(yàn)小鼠的生存狀態(tài) 在實(shí)驗(yàn)過程中，密切觀察小鼠的生存狀態(tài)。第1天,健康對照組、哮喘組、OVA-DC干預(yù)組小鼠未見任何異常。第7天腹腔注射OVA后，哮喘組和OVA-DC干預(yù)組小鼠行為稍顯遲緩，5～6 h后恢復(fù)正常。第14天腹腔注射OVA后，哮喘組小鼠行為遲緩，但對外界干擾有反應(yīng)，6 h后恢復(fù)正常；OVA-DC干預(yù)組小鼠趴伏不動(dòng)，對外界干擾無反應(yīng)，且在2 h內(nèi)可見大部分小鼠死亡，余下活鼠24 h后恢復(fù)正常。第27、28、29天連續(xù)霧化吸入1% OVA，霧化過程中可見哮喘組和OVA-DC干預(yù)組小鼠打噴嚏。

2.5 樹突細(xì)胞回輸后小鼠脾臟質(zhì)量變化 第14天腹腔注射OVA后，解剖小鼠取出脾臟，3組小鼠脾臟質(zhì)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，OVA-DC干預(yù)組較健康對照組和哮喘組升高，哮喘組較健康對照組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖4、表1)。

2.6 肺泡灌洗液組胺水平檢測 通過氣管插管收集肺泡灌洗液，回收率約為80%。ELISA法檢測結(jié)果顯示，3組肺泡灌洗液組胺水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=613.00，P=0.000)，OVA-DC干預(yù)組較健康對照組和哮喘組升高，哮喘組較健康對照組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖5)。

表1 3組脾臟質(zhì)量比較

注：與OVA-DC干預(yù)組比較，*P<0.05；與哮喘組比較，△P<0.05

圖4 各組小鼠脾臟大體形態(tài)

圖5 3組組胺水平比較

2.7 肺組織HE染色 HE染色顯示OVA-DC干預(yù)組小鼠肺組織氣道管壁增厚，周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤；哮喘組小鼠炎性反應(yīng)較輕；健康對照組小鼠未發(fā)現(xiàn)炎性反應(yīng)的特征(見圖6)。

3 討論

樹突細(xì)胞作為機(jī)體最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，可以攝取、加工和提呈抗原，激活初始T淋巴細(xì)胞，能介導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫系統(tǒng)對異物進(jìn)行識別和清除，是免疫系統(tǒng)的“衛(wèi)士”[7]。此外，樹突細(xì)胞還可以介導(dǎo)免疫耐受，在免疫自穩(wěn)、移植物耐受中發(fā)揮重要作用[8-11]。樹突細(xì)胞與過敏性疾病發(fā)生密切相關(guān)，參與過敏反應(yīng)的始動(dòng)環(huán)節(jié)[12]，因此，其在過敏性疾病中的研究應(yīng)用已受到人們的關(guān)注。

過敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制主要是Ⅰ型超敏反應(yīng)，目前有越來越多的研究表明，過敏性哮喘患者體內(nèi)樹突細(xì)胞在功能上存在一定異常，有偏向Th2反應(yīng)的趨勢[4]。哮喘患者肺組織和外周血中樹突細(xì)胞的數(shù)目也明顯增加，且在過敏性哮喘患者急性發(fā)病期，其外周血CD86、MHCⅡ表達(dá)明顯增高[5]。這些研究均表明樹突細(xì)胞在過敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

注：A為健康對照組，B為哮喘組，C為OVA-DC干預(yù)組

圖6 肺組織HE染色(×40)

Figure6 HE staining of lung tissues

本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞分化為樹突細(xì)胞并負(fù)載OVA,流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示負(fù)載OVA的樹突細(xì)胞和未處理的樹突細(xì)胞相比，MHCⅡ分子和CD86的表達(dá)量均處于低水平，且平均熒光強(qiáng)度很低，而用LPS刺激后的樹突細(xì)胞MHCⅡ分子和CD86的表達(dá)出現(xiàn)爆發(fā)式的升高，表明樹突細(xì)胞在負(fù)載OVA后仍處于未成熟狀態(tài)，該結(jié)果與吳衛(wèi)疆等[13]報(bào)道的情況一致。MLR也表明負(fù)載OVA的樹突細(xì)胞仍處于未成熟狀態(tài)，其刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力與未成熟樹突細(xì)胞相當(dāng)，僅當(dāng)樹突細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比例在1∶10時(shí)能微弱地刺激淋巴細(xì)胞增殖，而LPS刺激后的樹突細(xì)胞能強(qiáng)烈地刺激淋巴細(xì)胞增殖。尾靜脈注射負(fù)載OVA的樹突細(xì)胞后經(jīng)過致敏和激發(fā)，肺組織HE染色顯示，OVA-DC干預(yù)組小鼠肺組織支氣管黏膜水腫、增厚，周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，其炎癥表現(xiàn)明顯強(qiáng)于哮喘組小鼠。肺泡灌洗液中的組胺水平與肺組織HE結(jié)果一致。此外，本研究還通過腹腔注射OVA-DC，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果與尾靜脈注射相同。這一發(fā)現(xiàn)與之前的報(bào)道完全相反，負(fù)載OVA的樹突細(xì)胞經(jīng)腹腔注射給小鼠后可以在一定程度上抑制過敏性哮喘[12]。本實(shí)驗(yàn)中，OVA-DC干預(yù)組小鼠在第二次給予腹腔注射OVA后，小鼠活動(dòng)顯著減少，對外界干擾無反應(yīng)，生命狀態(tài)極差，2 h內(nèi)一半以上的小鼠死亡，尸檢發(fā)現(xiàn)脾臟極度增大，其體積是正常小鼠的3倍以上，也顯著大于哮喘組小鼠的脾臟，其余組織未發(fā)現(xiàn)異常。對于OVA-DC干預(yù)組小鼠的死亡，可能是因?yàn)閺?qiáng)烈的免疫反應(yīng)所致，但具體原因未能明確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，將負(fù)載OVA的樹突細(xì)胞尾靜脈注射或腹腔注射給小鼠會加重小鼠的過敏性哮喘反應(yīng)，并可能導(dǎo)致小鼠死亡?？赡苁且?yàn)樨?fù)載OVA的樹突細(xì)胞在進(jìn)入小鼠體內(nèi)后進(jìn)一步成熟，高表達(dá)MHCⅡ、CD86以及其他和抗原提呈相關(guān)的分子，然后激活T細(xì)胞發(fā)揮免疫反應(yīng)。相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，過敏性哮喘患者外周血中樹突細(xì)胞高表達(dá)MHCⅡ、CD80、CD86等與抗原提呈相關(guān)的分子[5,14]。此外，哮喘小鼠模型肺組織中樹突細(xì)胞也高表達(dá)MHCⅡ和CD80等共刺激分子[15-17]。并且在有過敏原刺激時(shí)，血液中的樹突細(xì)胞可以被募集到肺組織[18-19]。這些發(fā)現(xiàn)都說明樹突細(xì)胞在過敏性哮喘中發(fā)揮重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)將負(fù)載抗原的樹突細(xì)胞回輸至小鼠體內(nèi)可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，能加重過敏性哮喘反應(yīng)的嚴(yán)重程度，并能引起小鼠死亡。表明樹突細(xì)胞在血液和肺組織中數(shù)量的增加和抗原提呈相關(guān)分子的高表達(dá)都能促進(jìn)哮喘的發(fā)生。進(jìn)一步說明樹突細(xì)胞在過敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，為哮喘的預(yù)防和治療提供新的理論依據(jù)。對于負(fù)載抗原的樹突細(xì)胞回輸至體內(nèi)能增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)這一作用，還可能為其他疾病，如感染性疾病、腫瘤等疾病的預(yù)防和治療提供新思路。

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