石龍凱，楊 進，張小濤，侯宏衛(wèi)*，胡清源*

1.國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

2.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)蓮花街1號 450001

苯乙烯雖然毒性低，但可引起人體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的損傷［1-8］，國際癌癥研究機構(gòu)將其列為Group 2B 類，即對人類為可能致癌物［2］，半數(shù)致死劑量為5000 mg/kg（大鼠經(jīng)口）［3］；它是廣泛存在于卷煙煙氣中的一種半揮發(fā)性化合物［9-12］。吳銀菊等［13］測定了卷煙煙氣中的苯乙烯含量，方法的線性范圍為0.1～0.8 μg/mL，檢出限為0.03 ng/支。苯乙烯在煙氣粒相物和氣相物中均有分布，通常使用劍橋濾片和低溫冷阱同時捕集，再通過熱脫附或溶劑萃取后進行定量分析［12］，但操作繁瑣，對裝置要求苛刻。近年來，溶液吸收捕集方法逐漸發(fā)展起來，庹蘇行等［9］以甲醇為吸收溶液，采用氣質(zhì)聯(lián)用法測定了煙氣中的苯乙烯含量，過程簡便快捷，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。進入人體內(nèi)的苯乙烯在細胞色素P450 酶的作用下代謝為苯乙醛酸（phenylglyoxylic acid，PGA）和苯乙醇酸（mandelic acid，MA）（PGA 和MA 的結(jié)構(gòu)式見圖1），并能隨尿液排出［14］，故二者可以作為苯乙烯暴露劑量的生物標(biāo)志物［15］，即它們在人體代謝物中的檢出含量可反映機體受苯乙烯污染的程度，特別是當(dāng)二者都能檢測到時可信度更高。目前，尿液中苯乙烯代謝物的檢測方法主要有分光光度法［16-17］、氣相色譜法［14,18-20］、液相色譜法［21-29］、氣質(zhì)聯(lián)用法［13,19,30］和液質(zhì)聯(lián)用法［15,31］等；其中，液相色譜法應(yīng)用最為廣泛。但是尿液樣本基質(zhì)復(fù)雜，目標(biāo)物分離分析的效果不佳，分析時間長。因此，建立了測定吸煙與非吸煙者尿液樣本中PGA 和MA 含量的超高效液相色譜（UPLC）法，旨在為監(jiān)控吸煙人群尿液中苯乙烯代謝物的含量提供技術(shù)支持。

圖1 苯乙醛酸和苯乙醇酸的結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

共50 個尿液樣本，其中吸煙者和非吸煙者尿液樣本各25 個，由鄭州大學(xué)國家藥品臨床研究基地提供。所有志愿者在參加試驗前均須簽署一份知情同意書，志愿者為年齡在21～60 歲之間身體健康的成年男性。其中，吸煙者每人每天吸食15 支卷煙，非吸煙者不做處理；收集其24 h 尿液，儲存于－80 ℃冰箱中備用。

苯乙醛酸標(biāo)準(zhǔn)品（98%，加拿大Toronto Research Chemicals 公 司）；苯乙醇酸標(biāo)準(zhǔn)品（99.5%，美 國ChemService 公司）；二氯甲烷、異丙醇、甲醇（色譜純，韓國DUKSAN Pure Chemicals 公司）；醋酸（99.7%，美國TEDIA 公司）；磷酸（85%，天津科密歐試劑有限公司）；鹽酸（36～38%，山東雙雙化工有限公司）；超純水（自制）。

ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀，配有ACQUITY UPLC Sample Manager-FTN 進樣系統(tǒng)，ACQUITY UPLC H class Quaternary Solvent Manager 四元混合泵，ACQUITY UPLC PDA 檢測器和Empower 3 軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Waters 公司）；AL104 電子分析天平（感量0.0001 g，梅特勒-托利多儀器有限公司）；VX-2500 型渦旋振蕩器（美國HENRY TROEMNER LLC公司）；3-30K 型臺式高速冷凍離心機（德國SIGMA 公司）；TurboVap LV 型氮吹濃縮儀（瑞士BIOTAGE 公司）；Milli-Q 超純水機（美國Millipore 公司）；微孔水相濾膜（0.22 μm，上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 0.01%混合酸水溶液的配制

分別量取1.0 mL 醋酸和1.0 mL 85%磷酸于250 mL燒杯中，稀釋至100 mL，置4 ℃冰箱避光保存；用時取10 mL 用水稀釋至1 L，即為0.01%混合酸水溶液。

1.2.2 樣本處理與分析

尿液樣本于室溫下解凍，混合均勻，經(jīng)水相濾膜過濾，取1.0 mL 尿液置于10 mL 離心管中，加入1.0 mL 6 mol/L 的鹽酸和4.0 mL 混合萃取溶液（二氯甲烷∶異丙醇=9∶1，體積比），2000 r/min 渦旋振蕩提取3 min，10000 r/min 離心分離1 min，取1.0 mL 下層有機相置于玻璃試管中，40 ℃氮吹至干，加入0.2 mL 色譜分析時的流動相復(fù)溶，取5 μL 采用UPLC 法分離分析。分析條件為：

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?BEH（50 mm × 2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；流動相A：甲醇；流動相B：0.01%混合酸水溶液；洗脫條件：等度洗脫，A:B=15:85（體積比）；柱溫箱溫度：30 ℃；流動相流速：150 μL/min；分析時間：8 min；進樣量：5 μL；光電二極管陣列檢測器波長：苯乙醇酸225 nm,苯乙醛酸254 nm。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析及處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長

尿液樣本基質(zhì)復(fù)雜，許多雜質(zhì)會在短波區(qū)產(chǎn)生吸收，影響檢測器對目標(biāo)物的測定。為了避免干擾，實驗采用雙波長光電二極管陣列檢測器，在254 nm 處檢測苯乙醛酸、225 nm 處檢測苯乙醇酸時目標(biāo)物響應(yīng)最大且無干擾。此時，標(biāo)準(zhǔn)溶液中苯乙醛酸和苯乙醇酸的保留時間分別為2.083 和3.792 min；尿液樣本中二者的保留時間分別為2.091 和3.803 min。苯乙醛酸和苯乙醇酸的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖2 所示。

2.1.2 流動相

圖2 苯乙醛酸（a）和苯乙醇酸（b）的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

目標(biāo)物苯乙醛酸和苯乙醇酸屬于弱的有機酸類化合物，本研究選擇甲醇-混合酸水溶液作為流動相進行考察。實驗結(jié)果表明，流動相中的醋酸可以有效地減小色譜峰拖尾并抑制目標(biāo)物的離子化，改善峰形的對稱性，而磷酸能夠顯著增強兩種目標(biāo)物在色譜柱上的保留能力，使分離分析效果更出色。分別考察了20∶80,15∶85 和10∶90（體積比）甲醇-混合酸水溶液3 種流動相體系，通過分析目標(biāo)物的保留時間、分離度等因素，最終確定以甲醇-混合酸水溶液（15∶85，體積比）為流動相，等度洗脫。各組分能夠很好分離且峰形良好，所有目標(biāo)物在8 min 內(nèi)均可洗脫完全，提高了分析測試效率；而且以酸代替鹽作為改性劑能夠延長色譜柱的使用壽命，減少儀器系統(tǒng)的維護難度。

2.1.3 色譜柱

實驗考察了Agilent ZORBAX Eclipse plus C18(100 mm×2.1 mm，1.5 μm)，Waters ACQUITY UPLC?BEH(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，Waters ACQUITY UPLC?BEH(100 mm×2.1 mm，1.7 μm) 3 種色譜柱對尿液樣本中苯乙醛酸和苯乙醇酸的分離效果，其中ACQUITY UPLC?BEH(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)色譜柱對兩種目標(biāo)物的色譜分離峰型最好（見圖2），可滿足定性、定量分析要求。

2.2 工作曲線和檢測限

分別稱取42.5 mg 苯乙醛酸和100.0 mg 苯乙醇酸標(biāo)準(zhǔn)品，置于兩個不同的10 mL 棕色容量瓶中，用超純水定容至刻度，得到4.25 mg/mL 苯乙醛酸和10.00 mg/mL苯乙醇酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4 ℃下避光保存。分別準(zhǔn)確移取1 mL 上述儲備溶液，置于兩個不同的10 mL 棕色容量瓶中，用超純水定容至刻度，得到0.425 mg/mL 苯乙醛酸和1.000 mg/mL 苯乙醇酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4 ℃下避光保存。

準(zhǔn)確移取苯乙醛酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液10,20,100,200 和500 μL 于5 個10 mL 棕色容量瓶中，用超純水定容至刻度，得到0.425,0.850,4.250,8.500 和21.250 μg/mL 苯乙醛酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；準(zhǔn)確移取苯乙醇酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液10,20,100,200 和1000 μL 于5 個10 mL 棕色容量瓶中，用超純水定容至刻度，得到1,2,10,20 和100 μg/mL 苯乙醇酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

將以上制備的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液在優(yōu)化好的實驗條件下分析測定，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)作圖，得到苯乙醛酸和苯乙醇酸的線性回歸方程分別為y=1.12×105x+1.36×104和y=1.94×104x－2.48×103，其中y 代表目標(biāo)分析物的峰面積，x 表示尿液樣本中目標(biāo)分析物的濃度（μg/mL），線性相關(guān)系數(shù)分別為0.9995 和0.9998。結(jié)果表明，目標(biāo)物在0.425～21.500 和1～100 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。利用加標(biāo)稀釋法得到方法的定量限（S/N=10）和檢出限（S/N=3），苯乙醛酸和苯乙醇酸的定量限分別為0.013 和0.077 μg/mL。

2.3 回收率和精密度

采用尿液基質(zhì)加標(biāo)準(zhǔn)品的方法測定方法的回收率和精密度。選取10 個尿液樣本，混合均勻以后，選取低、中和高3 個添加水平加入標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度平行做6 次重復(fù)，按照優(yōu)化好的處理方法及檢測條件測定方法的回收率［以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）計］，結(jié)果見表1。由表1 可知，方法的回收率范圍是86.67～97.17%，RSD 均小于8%。表明方法的回收率好，可以滿足分析測試要求。

以上述不同濃度加標(biāo)尿液樣品在一天內(nèi)平行測定5 次，計算日內(nèi)精密度；每天對樣品進行測定，連續(xù)測定5 天，計算日間精密度，均以RSD 計，結(jié)果見表1。結(jié)果表明方法的精密度良好，可以滿足分析測試要求。

表1 苯乙醛酸和苯乙醇酸在尿液樣本中的回收率和精密度

2.4 方法應(yīng)用

圖3 尿液樣本中苯乙醛酸（a）和苯乙醇酸（b）的色譜圖

實驗測定的尿液樣本中苯乙醛酸和苯乙醇酸的色譜圖見圖3，測定結(jié)果見表2。吸煙者尿液樣本中苯乙醛酸的平均含量（以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差計，下同）為(0.575±0.44) μg/mL，苯乙醇酸的平均含量為(2.519±1.58)μg/mL；非吸煙者尿液樣本中苯乙醛酸的平均含量為(0.0359±0.026) μg/mL，苯乙醇酸 的平均含量為(0.437±0.34) μg/mL。其中吸煙者尿液樣本中苯乙醛酸和苯乙醇酸的檢出率分別為96%和100%，非吸煙者尿液樣本中苯乙醛酸和苯乙醇酸的檢出率分別為80%和88%。

表2 吸煙者與非吸煙者尿液樣本中苯乙醛酸和苯乙醇酸的含量

總體來看，本方法的測定結(jié)果與相關(guān)文獻［19,23-24］報道的尿液中苯乙醛酸和苯乙醇酸的含量范圍相一致。吸煙者尿液樣本中苯乙醛酸和苯乙醇酸的含量皆高于非吸煙者，且方差分析(Analysis of Variance,ANOVA)結(jié)果表明，二者之間呈現(xiàn)顯著性差異（P<0.05）。從圖4 可知，不管是吸煙者還是非吸煙者的尿液樣本中，苯乙醇酸的含量皆高于苯乙醛酸。分析原因可能與二者的代謝路徑有關(guān)，苯乙醇酸在抗利尿激素（乙醇脫氫酶）的作用下才會脫氫產(chǎn)生苯乙醛酸，因此苯乙醛酸的含量會受到人體內(nèi)乙醇脫氫酶代謝水平的影響。實驗中發(fā)現(xiàn)非吸煙者尿液樣本中兩種苯乙烯代謝產(chǎn)物會產(chǎn)生個別離散現(xiàn)象（見圖4 中點7 和點12），這可能與個體之間的代謝水平差異有關(guān)，也可能與其他苯乙烯暴露途徑有關(guān)。

圖4 吸煙者與非吸煙者尿液樣本中苯乙醛酸和苯乙醇酸含量箱型統(tǒng)計結(jié)果

3 結(jié)論

①超高效液相色譜法測定吸煙者和非吸煙者尿液樣本中苯乙醛酸和苯乙醇酸的檢出限分別為0.013 和0.077 μg/mL，目標(biāo)物與尿液樣本雜質(zhì)分離效果良好，操作簡便，分析時間大大縮短，方法的回收率以及精密度皆能滿足實驗要求。②對受試者尿液樣本的測定結(jié)果表明，吸煙者尿液樣本中苯乙醛酸和苯乙醇酸含量皆高于非吸煙者，且二者呈顯著性差異（P<0.05）。③本方法的建立可以有效地監(jiān)控吸煙人群尿液中苯乙烯代謝物的含量。

［1］沈波，沈惠麒，程懷民，等.職業(yè)接觸苯乙烯的生物限值研究［J］.海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2002，8（4）：4-6.

［2］Teixeira J P，Gaspar J，Coelho P，et al.Cytogenetic and DNA damage on workers exposed to styrene ［J］.Mutagenesis，2010，25（6）：617-621.

［3］Seeber A，Bruckner T，Triebig G.Occupational styrene exposure and neurobehavioural functions:A cohort study with repeated measurements ［J］.International Archives of Occupational and Environmental Health，2009，82（8）：969-984.

［4］Sato T，Kishi R，Gong Y，et al.Effects of styrene exposure on vibration perception threshold［J］.Neurotoxicology，2009，30（1）：97-102.

［5］Van Rooij J G M，Kasper A，Triebig G，et al.Trends in occupational exposure to styrene in the European glass fibre-reinforced plastics industry［J］.Annals of Occupational Hygiene，2008，52（5）：337-349.

［6］程懷民，沈波，阮宏錦，等.苯乙烯作業(yè)工人染色體畸變率與尿中代謝物相關(guān)性研究［J］.工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病，2002，28（1）：5-7.

［7］沈波，陳錦，程懷民，等.苯乙烯對青年男性工人遺傳毒性的研究［J］.海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2001，7（3）：4-6.

［8］梁婕，周乃根，肖國兵，等.苯乙烯對接觸男工腎功能影響的研究［J］.職業(yè)衛(wèi)生與應(yīng)急救援，1998，16（2）：57-59.

［9］庹蘇行，楊華武，吳名劍，等.甲醇溶液直接吸收-離子液體富集-GC/MS 法測定卷煙主流煙氣中吡啶、喹啉和苯乙烯［J］.分析化學(xué)，2012，40（7）：1053-1058.

［10］曲亞玲，白若石，周駿，等.GC/MS 法測定卷煙側(cè)流煙氣中半揮發(fā)性化合物吡啶、喹啉、苯乙烯［J］.中國煙草學(xué)報，2011，17（1）：1-7.

［11］趙國玲，鐘科軍，閆衛(wèi)東.熱裂解氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)研究煙草成分對煙氣組分的影響［J］.應(yīng)用化工，2008，37（10）：1188-1192.

［12］田海英，謝復(fù)煒，吳鳴，等.環(huán)境煙草煙氣中VOCs 的GC 分析［J］.煙草科技，2008（4）：30-35.

［13］吳銀菊，禹文峰，瞿白露，等.卷煙主流煙氣中吡啶、喹啉和苯乙烯的GC/MS 測定［J］.精細化工中間體，2011，41（4）：70-72.

［14］Cosnier F，Nunge H，Cossec B，et al.Simultaneous determination of aromatic acid metabolites of styrene and styrene-oxide in rat urine by gas chromatography-flame ionization detection［J］.Journal of Analytical Toxicology，2012，36（5）：312-318.

［15］Stragierowicz J，Miko?ajewska K，Zawadzka-stolarz M，et al.Biomarkers of occupational and environmental exposure to benzene and styrene determinated by LC-MS/MS［J］.Medycyna Pracy，2012，63（5）：565-572.

［16］葉能權(quán)，黃振儂，周紅妹.尿中對氨基酚的鹽酸萘乙二胺分光光度法［J］.工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病，1991，17（2）：103-105.

［17］Ohtsuji H，Ikeda M.A rapid colorimetric method for the determination of phenylglyoxylic and mandelic acids:Its application to the urinalysis of workers exposed to styrene vapour［J］.British Journal of Industrial Medicine，1970，27（2）：150-154.

［18］沈菊芳，陳彬武，鐘寶珍.氣相色譜法測定尿中馬尿酸和甲基馬尿酸［J］.勞動醫(yī)學(xué)，1989（4）：24-26.

［19］吳鴛鴦，施衛(wèi)星，陳樞青.GC/MS 同時檢測人體尿液中可的寧和苯乙醇酸及苯乙醛酸的含量［J］.浙江大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2009，38（3）：229-234.

［20］Dills R L，WU R L，Checkoway H，et al.Capillary gas chromatographic method for mandelic and phenylglyoxylic acids in urine［J］.International Archives of Occupational and Environmental Health，1991，62（8）：603-606.

［21］倪莉珍，陳楚良，金錫鵬.苯乙烯生物監(jiān)測指標(biāo)的研究［J］.中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，1991，9（3）：129-131.

［22］邵華，王曉云，程虎，等.苯乙烯生物標(biāo)志物的研究［J］.中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2003，21（2）：93-95.

［23］李小妮，孔令鈺，李楠，等.生物樣品中苯乙醛酸和苯乙醇酸的HPLC 測定方法［J］.藥物分析雜志，2012，32（12）：2158-2161.

［24］徐燁，張春妮，曹軼男，等.HPLC 法同時測定尿樣中芳香族化合物的6 種代謝產(chǎn)物［J］.分析測試學(xué)報，2011，30（9）：1028-1032.

［25］LEE C-W，LEE J，LEE J，et al.Rapid HPLC method for the simultaneous determination of eight urinary metabolites of toluene，xylene and styrene［J］.Bulletin of the Korean Chemical Society，2009，30（9）：2021-2026.

［26］Onchoi C，Kongtip P，Yoosook W，et al.High performance liquid chromatography for determination of urinary metabolites of toluene，xylene and styrene and its application［J］.Southeast Asian Journal Trop Med Public Health，2008，39（6）：1164-1171.

［27］張放，邵華.HPLC 法研究苯乙烯-DNA 的加合特性［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007，17（3）：385-387.

［28］李曉華，陳忠輝，李斌，等.高效液相色譜法測定尿中苯乙醛酸和苯乙醇酸［J］.中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2003，16（1）：46-47.

［29］倪莉珍，陳楚良，金錫鵬，等.反相高效液相色譜法測定尿苯乙醛酸和苯乙醇酸［J］.工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病，1990，16（5）：298-300.

［30］Pacenti M，Dugheri S，Villanelli F，et al.Determination of organic acids in urine by solid-phase microextraction and gas chromatography-ion trap tandem mass spectrometry previous‘in sample’derivatization with trimethyloxonium tetrafluoroborate［J］.Biomedical Chromatography，2008，22（10）：1155-1163.

［31］Reska M，Ochsmann E，Kraus T，et al.Accurate quantification of mercapturic acids of styrene（PHEMAs)in human urine with direct sample injection using automated column-switching high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2010，397（8）：3563-3574.