金黎明，劉李娜，許永斌，張麗影，鄭 維，范圣第

(1.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116605;2.海軍醫(yī)學(xué)研究所，上海 200443)

黨參(Codonopsis pilosula)是中國(guó)傳統(tǒng)補(bǔ)益藥，其味甘性平，有補(bǔ)中益氣、健脾生津之功效。其中黨參多糖(Codonopsis pilosula polysaccharide，CPP)系其主要有效成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗疲勞、降低膽固醇、降血脂、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)功能、促進(jìn)細(xì)胞增殖和骨細(xì)胞生長(zhǎng)、保護(hù)肝腎等器官損傷以及治療慢性蕁麻疹、糖尿病等多種功效［1］。

硒(selenium)是人體所必需的微量元素之一，具有抗氧化、延緩衰老、抗癌、增強(qiáng)人體免疫力等功效。但大多數(shù)無機(jī)硒化合物毒性較大，應(yīng)用受到極大的限制。硒多糖作為一種有機(jī)硒化合物，比無機(jī)硒安全，且兼有硒與多糖二者的優(yōu)點(diǎn)，更加易于機(jī)體的吸收和利用［2］。目前已有許多研究證明，硒多糖具有抗金屬中毒、抗氧化、抗癌細(xì)胞及抗病毒等多種作用［3－4］。

有些動(dòng)植物和微生物體內(nèi)含有天然硒多糖，但是含量很少，使得硒多糖的研究受到了一定限制。近年來，研究者嘗試使用人工方法獲得硒多糖，如在合適的培養(yǎng)條件下把無機(jī)硒添加到藻類、真菌等培養(yǎng)基中，通過生物體自身富集和轉(zhuǎn)化來獲得硒多糖［5－6］。此外，也可以利用化學(xué)合成方法獲得硒多糖。如硒化角叉菜膠［7］、硒化紅薯葉多糖［8］、硒化枸杞多糖［9］、硒化白沙蒿多糖［10］、硒化羧甲基殼聚糖［11］等多種富硒產(chǎn)品［12］，但是尚未見硒化黨參多糖的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以亞硒酸鈉和黨參多糖為原料合成硒化黨參多糖(selenium－Codonopsis pilosula polysaccharide，SeCPP)，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP－MS)法測(cè)定其中硒含量，利用紫外－可見光譜、紅外光譜兩種方法對(duì)其進(jìn)行表征，并采用鄰二氮菲－Fe2+氧化法和鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SeCPP的抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

儀器:7700X Series型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司);Lambda25型紫外－可見分光光度計(jì)(美國(guó)PE公司);370DTGS型紅外光譜儀(美國(guó)Thermo公司);DF－101S型恒溫磁力攪拌器(鞏義市英峪于華儀器廠);DHG－9070A型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);Seven Easy型pH計(jì)(上海梅特勒－托利多儀器有限公司)。

試劑:黨參提取物(西安天一生物技術(shù)有限公司);亞硒酸鈉、無水乙醇、冰乙酸、鹽酸、硝酸、甲苯、濃硝酸、雙氧水、鄰苯三酚、鄰二氮菲、抗壞血酸(Vc)等，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 黨參多糖的純化

稱取10 g黨參多糖提取物，加入100 mL蒸餾水將其溶解，加入20%體積的正丁醇－氯仿混合液(體積比為1∶5)，劇烈振蕩20 min。4 000 r·min－1離心10 min，傾出上清液，除去中間層變性蛋白和下層氯仿。重復(fù)以上操作，直至中間層無變性蛋白。向上清液中加入3倍體積的無水乙醇，冰箱冷藏過夜，得到多糖沉淀，冷凍干燥得到純化的CPP。

1.2.2 黨參多糖中多糖含量測(cè)定

用苯酚－硫酸法測(cè)定CPP中多糖含量［13］。

1.2.3 硒化黨參多糖的制備

參考梁淑軒［9］的方法，稱取1 g純化后的CPP溶解于25 mL超純水中，磁力攪拌溶解后加入1 mL冰醋酸。取1 g亞硒酸鈉溶于少量超純水，緩慢加入上述CPP溶液中，加熱至50℃，攪拌下反應(yīng)48 h。反應(yīng)畢，加入3倍體積無水乙醇，使其沉淀完全。離心得到沉淀后用無水乙醇洗滌3次，加入少量的超純水溶解，用超純水透析24 h，未透液經(jīng)冷凍干燥得到SeCPP。

1.2.4 紫外光譜法測(cè)定

將CPP和SeCPP用去離子水配成0.5 mg·mL－1的溶液，用去離子水為參比，進(jìn)行紫外光譜測(cè)定，波長(zhǎng)掃描范圍為190～400 nm。

1.2.5 紅外光譜法測(cè)定

將少量的CPP和SeCPP用KBr壓片，進(jìn)行紅外吸收光譜測(cè)定，測(cè)定范圍為400～4 000 cm－1。

1.2.6 電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP－MS)法測(cè)定硒含量

準(zhǔn)確稱取適量SeCPP于干燥的聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，加入4 mL硝酸及1 mL H2O2搖勻，密封，置入微波消解系統(tǒng)中進(jìn)行消解，消解完全后，用少量超純水洗罐3～4次，定容。用ICP－MS測(cè)定，樣品定量分析采用外標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)元素選用89Y。分別做3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算硒含量。儀器工作參數(shù)見表1。

表1 Agilent 7700X Series ICP－MS工作參數(shù)

1.2.7 抗氧化能力測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定CPP和SeCPP清除超氧陰離子自由基的能力，以Vc為對(duì)照實(shí)驗(yàn)［14］。

采用鄰二氮菲－Fe2+氧化法測(cè)定CPP和SeCPP清除羥自由基的能力，以Vc為對(duì)照實(shí)驗(yàn)［14］。

2 結(jié)果與討論

2.1 黨參多糖中多糖含量測(cè)定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，由此計(jì)算得出純化后的CPP中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為78.95%。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 硒化黨參多糖的制備及硒含量測(cè)定

得到的SeCPP為深棕色固體粉末，產(chǎn)率為43.65%。經(jīng)ICP－MS測(cè)定其中硒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25.92 mg·g－1。

目前化學(xué)法合成硒化多糖常用SeOCl2、亞硒酸、亞硒酸鈉等作為硒化試劑。Wang等［10］用H2SeO3/HNO3和BaCl2作催化劑，合成了硒化白沙蒿多糖，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)酸會(huì)使多糖降解。本實(shí)驗(yàn)參考了梁淑軒等［9］的方法，以醋酸作為催化劑，操作簡(jiǎn)單、安全，并綜合考慮制備成本及操作的簡(jiǎn)便性，確定反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為48 h。制備得到的SeCPP中硒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25.92 mg·g－1，高于某些文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果，如合成的硒化紅薯葉多糖中硒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 358 μg·g－1［8］、合成的硒化白沙蒿多糖中硒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1 703 μg·g－1［10］、合成的硒化羧甲基殼聚糖中硒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.50 mg·g－1［11］。

目前測(cè)定硒含量的方法有ICP－MS法、比色法、原子吸收光譜法、氣相色譜法及熒光分光光度法等，其中ICP－MS法因具有測(cè)定快速、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)被公認(rèn)為是較好的方法［15］。本文使用ICP－MS法測(cè)定硒含量，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3 紫外圖譜

黨參多糖和硒化黨參多糖的紫外吸收光譜圖如圖2。

圖2 黨參多糖和硒化黨參多糖的紫外吸收光譜圖

從圖2中可以看出，CPP經(jīng)硒化后，最大吸收峰從277 nm紅移到279 nm，同時(shí)，225 nm處的吸收峰消失。峰值的變化表明CPP結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，由此推測(cè)CPP中成功地引入了亞硒酸根。

2.4 紅外圖譜

黨參多糖和硒化黨參多糖的紅外光譜圖如圖3。

圖3 黨參多糖和硒化黨參多糖的紅外光譜圖

由圖3可知，經(jīng)硒化后的CPP紅外圖譜變化不大，說明多糖的結(jié)構(gòu)基本沒有改變。硒化后，在802 cm－1處出現(xiàn)有亞硒酸酯的特征吸收峰。CPP的C6－OH的伸縮振動(dòng)峰由1 027 cm－1紅移至1 022 cm－1，說明C6上的－OH可能參與了硒化反應(yīng)，形成－SeH結(jié)構(gòu)。

2.5 對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

黨參多糖和硒化黨參多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除率曲線如圖4。

圖4 黨參多糖和硒化黨參多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除率曲線

從圖4可以看出，在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，CPP和SeCPP對(duì)超氧陰離子自由基均有不同程度的清除作用。結(jié)果表明，CPP和SeCPP對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)，且SeCPP的清除作用強(qiáng)于CPP。質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL－1的CPP和SeCPP對(duì)超氧陰離子的清除率分別為47.05%和54.46%。

2.6 對(duì)羥自由基的清除作用

黨參多糖和硒化黨參多糖對(duì)羥自由基的清除率曲線如圖5。

圖5 Vc對(duì)超氧陰離子自由基的清除率曲線

從圖5可以看出，CPP和SeCPP對(duì)·OH均有一定的清除作用。結(jié)果表明，清除作用與質(zhì)量濃度成正比，且SeCPP的清除能力更強(qiáng)。質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL－1的 CPP 和 SeCPP，對(duì)·OH 的清除率分別達(dá)到了50.20%和61.75%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以亞硒酸鈉和CPP為原料合成SeCPP，經(jīng)ICP－MS測(cè)定其中硒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25.92 mg·g－1。利用紫外 － 可見光譜、紅外光譜兩種表征手段對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，證實(shí)了SeCPP的合成，硒化反應(yīng)主要通過C6上的－OH完成。SeCPP的抗氧化能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，且高于 CPP。2.0 mg·mL－1的 CPP和SeCPP對(duì)超氧陰離子自由基的清除率分別為47.05%和54.46%，對(duì)羥自由基的清除率分別為 50.20%和 61.75%。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，富硒產(chǎn)品的種類也越來越豐富，富硒雞蛋、富硒食用菌、富硒茶葉、富硒禽肉、富硒蔬菜瓜果、富硒干果、富硒保健品等相繼出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)合成了一種新型的有機(jī)硒產(chǎn)品——硒化黨參多糖，為進(jìn)一步研究低毒性、高活性的有機(jī)補(bǔ)硒劑提供了思路與參考。

［1］張馳，劉信平，周大寨，等.中國(guó)板黨中硒多糖提取分離技術(shù)研究［J］.食品科學(xué)，2006，27(10):314 －318.

［2］黃峙，鄭文杰，郭寶江，等.含硒生物大分子化合物研究進(jìn)展［J］.海南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2001，19(2):169－175.

［3］崔喬，尚德靜，鄒霞.硒多糖的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2003，24(3):155 －157.

［4］CHEN Hsien tung，TSAI Ying lan，CHEN Yueh sheng，et al.Dangshen(Codonopsis pilosula)activates IGF － I and FGF－2 pathways to induce proliferation and migration effects in RSC96 Schwann cells［J］.The American Journal of Chinese Medicine，2010，38(2):359 －372.

［5］XU C L，WANG Y Z，JIN M L，et al.Preparation，characterization and immunomodulatory activity of selenium－enriched exopolysaccharide produced by bacterium Enterobacter cloacae Z0206［J］.Bioresource Technology，2009，100:2095 －2097.

［6］張新宇，王雷，李光友，等.綠色巴夫藻硒多糖的提取分離與純化［J］.海洋與湖沼，2000，31(6):643 －646.

［7］唐家駿，苗海風(fēng).硒化角叉菜膠的制備及其理化性質(zhì)和生化活性研究［J］.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1988，20(3):259 －261.

［8］劉捷，張?bào)w祥，于立芹，等.硒化紅薯葉多糖的制備及抗氧化活性研究［J］.食品研究與開發(fā)，2009，20(7):8－11.

［9］梁淑軒，馬二紅，趙燕燕，等.醋酸催化下枸杞多糖的硒化修飾及抗腫瘤活性［J］.食品研究與開發(fā)，2011，32(3):160－164.

［10］WANG Junlong，ZHAO Baotang，WANG Xiaofang，et al.Synthesis of selenium － containing polysaccharides and evaluation of antioxidant activity in vitro［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2012，51:987－991.

［11］金黎明，覃仙玲，曹鵬，等.硒化羧甲基殼聚糖的合成及表征［J］.化學(xué)世界，2012，53(1):31－32.

［12］蔣步云，柴振林，朱杰麗，等.富硒產(chǎn)品的開發(fā)利用及研究現(xiàn)狀［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(11):446－448.

［13］趙曉蕾，王小瑜，李恃圻，等.莊河產(chǎn)薏苡仁中多糖含量的測(cè)定［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(27):17026 －17029.

［14］金黎明，郝苗，趙小菁，等.硒化殼寡糖的合成及抗氧化作用研究［J］.大連民族學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，14(5):445－448.

［15］王瑩，鐵梅，康平利，等.ICP－MS等三種測(cè)定蛹蟲草硒含量方法的比較［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2009，29(3):815－818.

(責(zé)任編輯 鄒永紅)