李麗華,徐顏美,李靜,黃波,劉靜,章海斌,陳鑫,陳希敏,林晉,黃林鳳,王小中

(1、深圳市寶安婦幼保健院檢驗(yàn)科,廣東深圳518133;2、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西南昌330006;3、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西南昌330006)

.論著.

江西漢族人群NRG3基因rs17101655 T→G單核苷酸多態(tài)性與ITP的關(guān)聯(lián)性研究

李麗華1,2*,徐顏美2*,李靜3,黃波2,劉靜2,章海斌2,陳鑫2,陳希敏2,林晉2,黃林鳳2,王小中2

(1、深圳市寶安婦幼保健院檢驗(yàn)科,廣東深圳518133;2、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西南昌330006;3、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西南昌330006)

目的運(yùn)用TaqMan探針法對NRG3基因rs17101655 T→G單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行基因分型,探討rs17101655 T→G單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)免疫性血小板減少癥(ITP)的關(guān)聯(lián)性,為該病的發(fā)病機(jī)制提供重要線索.方法針對NRG3基因rs17101655位點(diǎn)T→G多態(tài)性,設(shè)計(jì)1對PCR引物和TaqMan探針,通過實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增進(jìn)行基因分型;采用病例-對照研究,對中國漢族江西地區(qū)200例ITP和200例健康對照人群進(jìn)行基因分型,比較兩組人群基因型分布及頻率差異.結(jié)果Rs17101655位點(diǎn)T→G多態(tài)性的基因型和等位基因頻率分布在ITP病例組和對照組中分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).結(jié)論TaqMan探針法可快速、高效地對單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行基因分型,本研究結(jié)果顯示NRG3基因rs17101655位點(diǎn)不作為中國漢族人群ITP的易感位點(diǎn).

原發(fā)免疫性血小板減少癥;TaqMan探針;單核苷酸多態(tài)性

原發(fā)免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia,ITP)是一種獲得性自身免疫性疾病,成人發(fā)病率為5~10/10萬左右,該病的高發(fā)人群為育齡期女性及60歲以上老年人[1].主要臨床表現(xiàn)為全身皮膚黏膜或內(nèi)臟出血,嚴(yán)重者可出現(xiàn)顱內(nèi)出血[2].近年來,遺傳易感性在ITP的發(fā)病機(jī)制中的作用備受關(guān)注.研究者采用候選基因法已發(fā)現(xiàn)多種ITP的易感基因[3],但這些基因遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以解釋ITP發(fā)病的遺傳機(jī)制.最新研究排除飲食、藥物等多種血小板計(jì)數(shù)干擾因素后,發(fā)現(xiàn)NRG3基因與血小板計(jì)數(shù)顯著相關(guān)[4].考慮到ITP疾病主要由于血小板計(jì)數(shù)極度減低而出現(xiàn)一系列的臨床癥狀,因此本研究推測影響血小板計(jì)數(shù)變化的基因可能在ITP的發(fā)病機(jī)制中也發(fā)揮不可忽視的作用.為證實(shí)這一想法,本研究采用TaqMan探針技術(shù)初步探討NGR3基因rs17101655 T→G多態(tài)性與ITP的關(guān)聯(lián).

1 材料與方法

1.1 一般資料按《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診治的中國專家共識》診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]收集確診的ITP患者200例,以及與病例組年齡,種族,性別相匹配的健康體檢者200例,分別收取2ml EDTA抗凝靜脈血.病例組樣本來自于南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院2011年1月至2013年6月期間的住院和門診ITP患者,均為中國漢族人,無親屬關(guān)系及排除遺傳病史者.其中男性65例,女性135例,男:女=1: 2.1.所有樣本均來自江西地區(qū),個(gè)體間無地域差異性.

1.2 儀器與試劑ViiA7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司),Theromo NanoDrop 2000C紫外/可見分光光度定量儀(中國賽默飛世爾科技有限公司), LX-100手掌型離心機(jī)(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司).

血液基因組柱式提取試劑盒(德國Qiagen公司), TaqMan SNP Genotyping Assays(美國Life Technologies),TaqManR Genotyping Master Mix(美國Life Technologies),ddH2O(本實(shí)驗(yàn)室自備的無菌水).

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取、檢測及稀釋采用天根血液基因組柱式提取試劑盒嚴(yán)格按說明書操作提取抗凝靜脈血中的全基因組DNA,通過Theromo NanoDrop 2000C紫外/可見分光光度定量儀器進(jìn)行DNA定量檢測,記錄DNA純度和濃度值.以純度OD260/280位于1.8~2.0為合格樣本.并用ddH2O將DNA母液定量稀釋至15μl終濃度為20ng/μl工作液,用于后續(xù)TaqMan分型檢測.

1.3.2 TaqMan探針和引物設(shè)計(jì)針對rs17101655 T→G位點(diǎn)所設(shè)計(jì)的兩條探針分別用VIC和FAM進(jìn)行熒光標(biāo)記,由美國ABI Life technology公司設(shè)計(jì)并合成,探針及引物貯存液為40倍濃縮液(40X TaqMan SNP Genotyping Assay Mix).ABI公司合成rs17101655 T→G探針試劑編號(Assay ID)為AHD19QU.

1.3.3 rs17101655 T→G分型PCR總反應(yīng)體系為10μl,包括(2XTaqMan Genotyping Master Mix)5μl、引物與探針混合液(40XTaqMan SNP Genotyping Assay Mix)0.25μl、模板DNA(20ng/μl)1μl、ddH2O 3.25μl.每96孔板設(shè)置1個(gè)空白對照.反應(yīng)程序?yàn)閜re-read stage 60℃,30s;hold stage:95℃,10min;反應(yīng)條件為95℃,15s,60℃1min,60℃30s,共40個(gè)循環(huán);post-read stage 60℃1min.反應(yīng)在ViiA7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)進(jìn)行,利用TaqMan Genotyper軟件自動基因分型.

1.3.4 基因分型結(jié)果判定Life technology公司采用VIC和FAM熒光素標(biāo)記rs17101655位點(diǎn)的G和T等位基因.當(dāng)樣本基因型為純合子GG時(shí), PCR擴(kuò)增曲線顯示VIC熒光信號值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于FAM熒光信號值;當(dāng)樣本基因型為純合子TT時(shí),PCR擴(kuò)增曲線顯示FAM熒光信號值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于VIC熒光信號值;當(dāng)樣本基因型為雜合子TG時(shí),PCR擴(kuò)增曲線顯示FAM熒光信號值約等于VIC熒光信號值.

1.4 統(tǒng)計(jì)分析采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算SNP多態(tài)位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率,以擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)分析基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡定律.采用比值比(odds ratio,OR)和95%置信區(qū)間(95%confidence interval,CI)分析基因多態(tài)性與ITP的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度.P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)病例組和對照組人群rs17101655 T→G位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05),表明本研究人群來自遺傳平衡的群體,見表1.

表1 基因型頻數(shù)分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

2.2 rs17101655位點(diǎn)等位基因的TaqMan分型結(jié)果rs17101655位點(diǎn)具有T和G兩種等位基因,共TT、TG和GG 3種基因型.本實(shí)驗(yàn)分型結(jié)果顯示ITP組TT型187例,TG型12例,GG型1例;對照組TT型194例,TG型6例,GG型0例(見圖1),該結(jié)果與人類基因組計(jì)劃(HapMap)公布的中國北京人的SNP分型數(shù)據(jù)相一致.

2.3 rs17101655位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率與中國漢族江西地區(qū)ITP的關(guān)系ITP病例組rs17101655位點(diǎn)TT、TG和GG基因型頻率分別為93.5%、6%和0.5%,對照組的基因型頻率分別為97.0%、3.0%和0.0%.rs17101655位點(diǎn)與ITP疾病的發(fā)生存在一定的風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.07,95%CI=0.76~ 5.64),但該位點(diǎn)的基因型頻率在兩組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.13,P=0.34)(見表2).等位基因T在ITP病例組和對照組中的頻率分別為96.5%和98.5%,等位基因G在ITP病例組和對照組中的頻率分別為3.5%和1.5%.G等位基因?yàn)轱L(fēng)險(xiǎn)等位基因(OR=2.38,95%CI=1.19~4.75).兩組人群間等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.51,P=0.11)見表3.

圖1 TaqMan技術(shù)分型rs17101655位點(diǎn)等位基因的結(jié)果

表2 rs17101655位點(diǎn)基因型頻率分布及其與ITP的關(guān)系

表3 rs17101655位點(diǎn)等位基因頻率分布及其與ITP的關(guān)系

3 討論

為深入理解ITP的遺傳機(jī)制,研究者紛紛采用候選基因法發(fā)現(xiàn)63種ITP的易感基因,主要集中于細(xì)胞因子、Fc受體、DNA甲基化和HLA等方面[6].但這些基因不足以充分解釋ITP的發(fā)病機(jī)制.研究者對75例健康兒童,排除多種干擾因素后,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3(NRG3)基因與血小板計(jì)數(shù)顯著相關(guān)[4],但其具體的作用機(jī)制仍然不清.考慮到ITP主要由于血小板計(jì)數(shù)極度減低而出現(xiàn)一系列的臨床癥狀,因此本研究推測影響血小板計(jì)數(shù)的基因可能在ITP的發(fā)病過程中起重要作用.因此本研究采用病例-對照研究方案,通過TaqMan探針技術(shù)對江西地區(qū)部分ITP患者進(jìn)行NRG3基因rs17101655 T→G單核苷酸多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性研究.

目前,國內(nèi)外尚無ITP疾病與NRG3基因rs17101655 T→G位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性研究報(bào)道,本研究為首次對ITP與NRG3基因的關(guān)聯(lián)性研究.結(jié)果顯示ITP病例組rs17101655位點(diǎn)TG基因型頻率(6.0%)高于對照組(3.0%),但rs17101655位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率在兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).本研究結(jié)果表明rs17101655 T→G位點(diǎn)與ITP的發(fā)病無潛在關(guān)聯(lián).由于樣本量小,研究對象和地域局限,其結(jié)果代表性不強(qiáng),因此需要更多的大規(guī)模病例對照研究來進(jìn)一步證實(shí)該位點(diǎn)與ITP的關(guān)聯(lián)性.另外,NRG3基因可能在正常生理情況下控制血小板計(jì)數(shù),而在ITP這種病理環(huán)境下并不起控制血小板計(jì)數(shù)的主導(dǎo)作用.

此外,本研究進(jìn)一步證實(shí)TaqMan探針法能高效準(zhǔn)確地進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分型,具有操作簡便、省時(shí)、省力等優(yōu)點(diǎn).鑒于探針與引物混合液對外界DNA極其敏感,易受空氣中氣溶膠等的影響,因此在TaqMan探針法實(shí)驗(yàn)實(shí)際操作過程中應(yīng)嚴(yán)格在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行,且操作前應(yīng)對移液槍等器材進(jìn)行紫外線消毒,以避免外界DNA混入PCR反應(yīng)體系中,而導(dǎo)致分型錯(cuò)誤.

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A study of the correlation between NRG3 gene rs17101655 T→G single nucleotide polymorphism and ITP in Han popu-lation of Jiangxi

LI Lihua,XU Yanmei,LI Jing,et al.Department of Clinical Laboratory,the Maternity and Child Health Care Hospital of Baoan District in Shenzhen,Shenzhen Guangdong 518133,China

ObjectiveTo explore the correlation between NRG3 rs17101655 T→G single nucleotide polymorphism and primary immune thrombocytopenic purpura(ITP)with the TaqMan probe technology,and provide novel important clues for understanding the pathogenic mechanism of ITP.MethodsA case-control study was applied to detect rs17101655 T→G polymorphism, a total of 200 ITP patients and 200 controls were enrolled from the Han population of Jiangxi region in China.One pair of special TaqMan probe and PCR primers for NRG3 rs17101655 T→G single nucleotide polymorphism was designed,and the genotyping was conducted by real-time PCR.Then the difference of genotype distribution and allele frequency between the two groups was compared.ResultsThe genotype distribution and allele frequency of rs17101655 T→G polymorphism between cases and controls have not significantly statistical difference(P>0.05).ConclusionsThe TaqMan probe method can rapidly and efficiently genotyping for single nucleotide polymorphisms.Our results showed that NRG3 gene rs17101655 polymorphism cannot be a susceptibility locus for ITP in the Han population of Jiangxi.

Primary immune thrombocytopenic purpura;TaqMan probe;Single nucleotide polymorphism

R558+.2

A

1674-1129(2014)03-0237-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.03.002

2014-02-20;

2014-02-27)

江西省教育廳課題基金資助項(xiàng)目(No:GJJ13157);江西省研究生創(chuàng)新專項(xiàng)基金資助金項(xiàng)目(No:YC2012-S027).作者簡介:李麗華,女,1978年出生,在職研究生,研究方向:血小板疾病及診斷.

徐顏美,女,1989年出生,南昌大學(xué)在讀研究生,研究方向?yàn)檠翰∵z傳學(xué)*(共同第一作者).

王小中,男,1973年生,博士生導(dǎo)師.