吳瓊,李潔,方江春,賀文鳳

(1、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌330006;2、萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院血液科,江西萍鄉(xiāng)337055)

CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+檢測(cè)在急性髓系白血病中的應(yīng)用

吳瓊1,李潔1,方江春2,賀文鳳1

(1、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌330006;2、萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院血液科,江西萍鄉(xiāng)337055)

目的探討CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+檢測(cè)與急性髓系白血病的發(fā)病機(jī)制、治療效果及預(yù)后的關(guān)系,并與CD4+CD25+/CD4+法比較兩種檢測(cè)方法是否存在差異.方法應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)法分別檢測(cè)41例初治AML患者(初治組)、11例一次化療緩解的患者(化療敏感組)、9例兩次以上化療不緩解的患者(化療耐藥組)、13例化療緩解后一直沒有復(fù)發(fā)的患者(持續(xù)緩解組)、8例化療緩解后又再次復(fù)發(fā)的患者(復(fù)發(fā)組)和20例健康體檢者(對(duì)照組)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+及CD4+CD25+/ CD4+在外周血中的比例.結(jié)果與對(duì)照組相比較,AML患者初治組兩類細(xì)胞比例均較正常人明顯升高(P<0.01),初治患者組兩種檢測(cè)方法間存在顯著差異(P<0.01).與化療緩解組比較,化療耐藥組兩種檢測(cè)方法檢測(cè)的比例均明顯升高(P<0.01),耐藥患者組兩種方法間存在顯著差異(P<0.01).與持續(xù)緩解組比較,復(fù)發(fā)組患者的比例明顯升高(P<0.01),復(fù)發(fā)組兩種方法間存在顯著差異(P<0.01).結(jié)論急性髓系白血病患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+與急性髓系白血病的發(fā)生相關(guān),并且檢測(cè)其比例能預(yù)測(cè)白血病患者對(duì)化療藥物的反應(yīng)及預(yù)后,且其靈敏度高于CD4+CD25+/CD4+檢測(cè)法,而其特異性與CD4+Foxp3+/CD4+檢測(cè)法一致.

CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;急性髓系白血病;流式細(xì)胞術(shù)

急性白血病是一類造血干細(xì)胞異常的克隆性惡性疾病,目前對(duì)于急性白血病的治療最有效的手段是造血干細(xì)胞移植,然而由于供者來源的局限性、手術(shù)費(fèi)用高等因素使得免疫治療逐漸成為了治療腫瘤的新手段.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞與血液腫瘤的發(fā)生有著密切聯(lián)系,以往研究將CD4+CD25+Treg細(xì)胞作為腫瘤免疫機(jī)制研究的主要對(duì)象,然而由于CD25并不是Treg的獨(dú)特標(biāo)志,使得有關(guān)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的研究存在矛盾的結(jié)果.本研究通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)比較了正常人、急性髓系白血病初治者、緩解者及復(fù)發(fā)者外周血CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+在外周血中的比例,并與CD4+CD25+/CD4+法進(jìn)行比較,從而探討CD4+CD25+Foxp3+與急性白血病的發(fā)病機(jī)制、治療效果及預(yù)后的關(guān)系,探討兩者間更為敏感和特異的檢測(cè)方法,為急性白血病的發(fā)病機(jī)制及免疫治療提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象選取南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科2009年2月-2011年12月所有急性髓系白血病住院患者,總共41例,男性24例,女性17例,平均年齡45歲.所有急性白血病患者均經(jīng)過臨床、骨髓細(xì)胞學(xué)、染色體、白血病免疫分型確診.依據(jù)FAB分型M3 15例,M2 17例,M4 3例,M16例.將上述初治病人經(jīng)一次化療緩解的患者作為化療敏感組,總共11例;經(jīng)兩次以上化療不緩解的患者作為化療耐藥組,總共9例;經(jīng)一次化療緩解后不再?gòu)?fù)發(fā)的患者作為持續(xù)緩解組,總共13例;經(jīng)化療緩解后又再次復(fù)發(fā)的患者作為復(fù)發(fā)組,總共8例.診斷及療效均符合鄧家棟編著的《臨床血液病學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)》之國(guó)內(nèi)診療標(biāo)準(zhǔn).正常對(duì)照組來自我院體檢中心,其中男性11例,女性9例,平均年齡32歲.

1.2 主要試劑和儀器用于Treg細(xì)胞檢測(cè)的熒光抗體:PE標(biāo)記的鼠抗人IgG抗體、FITC標(biāo)記的抗人CD4、APC標(biāo)記的抗人CD25、PE標(biāo)記的抗人Foxp3抗體以及10X的破膜劑和溶血素,以上試劑均來自美國(guó)BD公司;流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司Fascalibur型四色流式細(xì)胞儀;移液器為美國(guó)eppendorf公司;臺(tái)式離心機(jī)為上海飛鴿牌TDL-5-A型.

1.3 Treg細(xì)胞檢測(cè)采集外周血2ml加入EDTA抗凝管,充分混勻;準(zhǔn)備兩根流式管,標(biāo)明同型對(duì)照管和檢測(cè)管,分別以1、2表示;取外周血100ul分別加入兩管,1、2管都加入CD4-FITC/CD25-APC各20μl,暗室室溫避光孵育20~30min;避光孵育后加入稀釋的溶血素和破膜劑,反應(yīng)后以破膜緩沖液洗滌并重懸,1管加入IgG-PE 5μl,2管加入Foxp3-PE 20μl,暗室室溫避光孵育20~ 30min;加入5ml PBS緩沖液洗滌,1200r/min離心5min去上清.加入400μlPBS緩沖液上機(jī)檢測(cè).用FSC/SSC參數(shù)先找到淋巴細(xì)胞群,找到CD4+CD25+雙陽細(xì)胞群,IgG-PE為同型對(duì)照,使用對(duì)照管調(diào)整補(bǔ)償和電壓,使得陰性細(xì)胞群位于點(diǎn)圖的左下角,收集至少10000個(gè)細(xì)胞,以CD4+CD25+雙陽細(xì)胞射門,分析Foxp3的百分率,在計(jì)算機(jī)上用Cell Quest軟件分析數(shù)據(jù),減去陰性對(duì)照管的非特異性對(duì)照值.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 正常人和急性白血病患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的表達(dá)20例對(duì)照組外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+細(xì)胞比例為(1.05±0.10)%,CD4+CD25+/CD4+細(xì)胞比例為(0.98± 0.07)%,兩者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).41例初治組的比例分別為(49.37±2.08)%及(5.56±0.38)%,兩者間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),初治患者CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+均高于正常人,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01).見表1.

表1 正常人、急性白血病初治患者外周血Foxp3+的表達(dá)

2.2 化療耐藥和化療敏感患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的表達(dá)9例化療耐藥組外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+細(xì)胞比例為(47.97±0.91)%,CD4+CD25+/CD4+細(xì)胞比例為(6.87± 0.58)%,兩種方法具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01).11例化療敏感組的比例分別為(0.91±0.07)%及(0.85±0.05)%,兩種方法間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).化療耐藥組患者CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+細(xì)胞比例及CD4+CD25+/CD4+細(xì)胞比例均高于化療敏感組患者,兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01).見表2.

表2 化療耐藥組、化療敏感組患者外周血Foxp3+的表達(dá)

2.3 持續(xù)緩解患者和復(fù)發(fā)患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的表達(dá)13例持續(xù)緩解組外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+細(xì)胞占CD4+CD25+/CD4+細(xì)胞比例分別為(1.67±0.06)%和(1.52± 0.12)%,兩者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).8例復(fù)發(fā)組比例分別為(50.50±1.46)%及(6.58±0.59)%,兩者間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),復(fù)發(fā)患者CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+均高于持續(xù)緩解者,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01).見表3.

表3 持續(xù)緩解組、復(fù)發(fā)組患者外周血Foxp3+的表達(dá)

3 討論

Treg是CD4+T細(xì)胞的一種獨(dú)特的亞型,是一類具有免疫無反應(yīng)性和免疫抑制性的T細(xì)胞亞群,具有主動(dòng)調(diào)控或抑制其他免疫活性細(xì)胞的功能,在免疫反應(yīng)中起到關(guān)鍵性的作用.以往研究認(rèn)為白介素-2(IL-2)受體α鏈(CD25)是Treg細(xì)胞的特異標(biāo)志,并將CD4+CD25+作為研究Treg的標(biāo)志.目前有關(guān)CD4+CD25+與腫瘤的關(guān)系已經(jīng)有了大量的研究,在胃癌、乳腺癌、肝癌等多種實(shí)體瘤患者的外周血和腫瘤局部,CD4+CD25+Treg的數(shù)量都比正常人明顯增高[1-3].Beyer等[4]對(duì)3例慢性淋巴細(xì)胞白血病患者和42例正常人外周血進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)CTLA4+、Foxp3、GITR、TGF-β1、CD62L+、IL-10在慢性淋巴細(xì)胞白血病初治患者中的表達(dá)較正常人明顯升高.慢性淋巴細(xì)胞白血病患者在使用氟達(dá)拉濱連續(xù)化療后,外周血中的Tregs相應(yīng)下調(diào),并且出現(xiàn)了抑制功能的減弱,甚至消失.Beyer等[4-5]對(duì)急性髓系白血病患者的CD4+CD25+Treg細(xì)胞進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)患者組CD4+CD25+Treg細(xì)胞占外周血CD4+T細(xì)胞中的比例較正常對(duì)照組明顯增高,而且與患者的病程、疾病的預(yù)后明顯相關(guān),提示腫瘤患者血清中可能存在某種能夠促進(jìn)CD4+CD25+Treg細(xì)胞生成的物質(zhì),使之具有天然的免疫反應(yīng),并具有促進(jìn)機(jī)體免疫抑制的作用.然而,腫瘤抗原特異的免疫治療效果目前并不令人十分滿意,有關(guān)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的研究結(jié)果也存在一定的不一致性,研究者們開始考慮這種結(jié)果的不一致是否與CD4+CD25+不能特異性的代表Treg細(xì)胞有關(guān)[6].

Foxp3屬于foxhead家族分叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,是細(xì)胞獲得免疫調(diào)節(jié)特性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,目前認(rèn)為Foxp3是Treg細(xì)胞的特異標(biāo)志,其表達(dá)正常是CD4+CD25+Treg發(fā)揮作用的前提[7]. Rudemky[8]等研究證明Foxp3在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性表達(dá),有著調(diào)控Tregs的發(fā)育及功能的作用. Shenghui Z[9]等利用多色流式細(xì)胞術(shù)在外周血和骨髓中檢測(cè)CD127、CD4和CD25來鑒定出Foxp3+Treg,研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+CD127lowTreg頻率顯著增加,并且在初治的AML病人的外周血中它們的表型是不同于健康志愿者,當(dāng)AML治療完全緩解后Treg頻率下降了,當(dāng)AML復(fù)發(fā)后Treg頻率又上升了.在完全緩解的病人診斷時(shí)期外周血和骨髓的Treg頻率要低于持續(xù)不能緩解的病人.目前有關(guān)CD4+CD25+Foxp3+與急性白血病發(fā)病機(jī)制、預(yù)后等方面的研究還未見報(bào)道.

本研究通過流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)初治患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+的比例高于正常對(duì)照;耐藥組患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+的比例高于化療敏感組;復(fù)發(fā)組患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+的比例高于持續(xù)緩解組;初治患者組、耐藥組及復(fù)發(fā)組兩種檢測(cè)方法存在顯著差異, CD4+CD25+/CD4+結(jié)果與以往報(bào)道相似[10],CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+檢測(cè)法與對(duì)照的差異顯著高于CD4+CD25+/CD4+檢測(cè)法.

通過本研究提示急性白血病患者體內(nèi)CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞增高可能導(dǎo)致了白血病細(xì)胞逃避免疫清除,抑制了機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)白血病細(xì)胞的有效攻擊,使白血病細(xì)胞產(chǎn)生免疫逃逸,從而導(dǎo)致白血病的發(fā)生.CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的比例增高可能提示患者對(duì)化療藥物反應(yīng)差,患者很難達(dá)到緩解,CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量有可能是預(yù)測(cè)患者對(duì)藥物療效的重要指標(biāo)之一.CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的數(shù)量可能是引起急性白血病的復(fù)發(fā)的原因之一,并有可能作為一項(xiàng)提示疾病復(fù)發(fā)的指標(biāo).檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+檢測(cè)法可能比以往報(bào)道的檢測(cè)CD4+CD25+/CD4+的方法更敏感,而特異性一致.因此,CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的檢測(cè)可能能更好的作為預(yù)測(cè)患者療效、監(jiān)測(cè)疾病復(fù)發(fā)和判斷預(yù)后的一個(gè)指標(biāo).

CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞是急性白血病患者免疫抑制并導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的一個(gè)重要原因之一,下調(diào)Treg細(xì)胞數(shù)量或功能有可能提高患者抗腫瘤免疫效應(yīng),這為以Treg為靶標(biāo)的免疫調(diào)控治療策略提供有益的啟示,為臨床最終治愈AML患者提供新的策略.

[1]孫廣增.胃癌患者血清NO、IL-2及CD4+CD25+水平變化及臨床意義[J].山東醫(yī)藥,2011,51(27):86-87.

[2]王嗣予,福軍亮,呂吉云,等.原發(fā)性肝癌患者體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成和數(shù)量增加與疾病進(jìn)展相關(guān)分析[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2011,27(6):668-670.

[3.]Li C H,Kuo W H,Chang W C,et al.Activation of regulatory T cells instigates functional down-regulation of cytotoxic T lympho-cytes in human breast cancer[J].Immunol Res,2011,51(1):71-9.

[4]Beyer M,Kochanek M,Darabi K,et al.Reduced frequencies and sup-pressive function of CD4+CD25+regulatory T cells in patients with chronic lymphocytic leukemia after therapy with fludarabine [J].Blood,2005,106(6):2018-2025.

[5]Wang X,Zheng J,Liu J,et al.Incerased population of CD4+CD25+ high regulatory T cells with their higer apoptotic and proliferating status in peripheral blood of acute myeloid Leukemia patients[J]. Eur J Haematol,2005,75(6):468-476.

[6]呂凌.介導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育與功能的一個(gè)關(guān)鍵基因-Foxp3[J].國(guó)際免疫學(xué)雜志,2006,29(2):65-68.

[7]Brunkow ME,Jeffery EW,Hjirrild KA,et al.Disruption of a new fork-head/winged-helix protein,scurfin,results in fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse[J].Nat Genet,2001,27 (1):68-73.

[8]Fontenot JD,Gavin MA,Rudemky AY.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells[J].Nat Immunol,2003,4(4):330-336.

[9]Shenghui Z,Yixiang H,Jianbo W,et al.Elevated frequencies of CD4 CD25 CD127lo regulatory T cells is associated to poor prognosis in patients with acute myeloid leukemia[J].Int J Cancer, 2011,129(6):1373-1381.

[10]陶貞霞,郭曉玲,孟宇,等.CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)在急性髓細(xì)胞白血病中的臨床意義[J].臨床血液學(xué)雜志,2013,26(7):452-454.

The application of detecting CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+Tregs in acute leukemia

ObjectiveTo explore the significance of CD4+CD25+Foxp3+Tregs detection in the pathogenesis,curative effect and prognosis of acute leukemia,and compare it with the method of CD4+CD25+/CD4+detection and determine whether there is difference between the two methods.MethodsThe proportion of CD4+CD25+Foxp3+Tregs cells in the peripheral blood were tested in 41 cases of untreated patients with AML(Initial treatment group),11 cases of remission-patients after one period of chemotherapy (Chemotherapy sensitive group),9 cases of non-remission-patients after two period of chemotherapy(Chemotherapy resistance group),13 cases of recurrence-free-patients achieving chemotherapy remission(Sustained remission group),8 relapsed patients achieving Chemotherapy remission(Relapse group),20 cases of healthy donators(control group)by using flow cytometry,and the proportion of CD4+CD25+Foxp+Tregs cells in the peripheral blood with the method of CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+and CD4+CD25+/CD4+were detected.ResultsThe proportion of CD4+CD25+Foxp3+Tregs cells in the peripheral blood of initial treatment group was greatly higher than that of control group,but there was no difference between the two methods of CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+and CD4+CD25+/CD4+detection.The proportion of CD4+CD25+Foxp3+Tregs cells in the peripheral blood of chemotherapy resistance group was greatly higher than that of chemotherapy sensitive group,but there was no difference between the two methods of CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+and CD4+CD25+/CD4+detection in the chemotherapy resistance group and chemotherapy sensitive group.The proportion of CD4+CD25+Foxp3+Tregs cells in the peripheral blood of relapse group was greatly higher than that of sustained remission group,but there was no difference between the two methods of CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+and CD4+CD25+/ CD4+detection in the relapse group and sustained remission group.ConclusionsThe significant increased rate of CD4+CD25+Foxp3+Tregs cells in peripheral blood of AML patients may be related to the occurrence of leukemia and the detection of the proportion of CD4+CD25+Foxp3+Tregs can predict prognosis and response to chemotherapy in patients with leukemia.And its detection sensitivity is higher than that of the CD4+CD25+/CD4+detection method,but its specificity is consistant with the method ofCD4+Foxp3+/CD4+assay.

CD4+CD25+Foxp3+Tregs;Foxp3;Acute leukemia;Flow cytometry

R733.7,R446.62

A

1674-1129(2014)03-0246-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.03.005

2013-10-31;

2013-11-26)

江西省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃(編號(hào):20093049)

吳瓊,女,1984年出生,主管技師,醫(yī)學(xué)檢驗(yàn),研究方向流式細(xì)胞術(shù).

李潔,女,1963出生,實(shí)驗(yàn)師,研究方向?yàn)榱魇郊?xì)胞術(shù).

WU Qiong,LI Jie,FANG Jiangchun,etal.The Key Molecular Medical Laboratory of Jiangxi Province,the Second Affilicated Hospital of Nanchang University,Nanchang330006,China