郭曉謹(jǐn)，周夢(mèng)佳，李 峰，李芳赫，萬(wàn)亮琴，張 賽， 馬家寶，李衛(wèi)紅△，李興廣△

(1．北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2. 通州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京 101100)

近年來(lái)研究表明，腦缺血后受損的腦組織可出現(xiàn)神奇的再塑性，神經(jīng)元發(fā)生的機(jī)制與血管發(fā)生有重要的相關(guān)性，所以促進(jìn)缺血后的血管新生成為腦缺血后治療的新思路[1]。通絡(luò)救腦注射液是由梔子苷和三七總皂苷2種組分配伍而成的現(xiàn)代注射劑。前期研究顯示，通絡(luò)救腦注射液及其2組分均可有效提高擬缺血損傷內(nèi)皮細(xì)胞活性，減輕缺血內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，且2組分在發(fā)揮抗氧化作用途徑方面各有所側(cè)重[2]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，觀察通絡(luò)救腦注射液及其2有效組分對(duì)擬缺血損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞BDNF的表達(dá)影響，從血管再生因子角度闡釋該注射液的藥效及配伍機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

原代的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，采用實(shí)驗(yàn)室已建立的方法[3]進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng)。

1.2 擬缺血損傷模型的制備

采用本實(shí)驗(yàn)室已建立的糖氧剝奪模型[4]，細(xì)胞傳至第三代，用無(wú)糖的Kreb’s液置換原培養(yǎng)基，放入低氧培養(yǎng)箱(氣體含量為94%N2，5%CO2，1%O2)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)6h。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理

培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分成5組，分別為正常組、模型組、梔子苷組、三七總皂苷組、通絡(luò)救腦注射液組。除正常組外，其余各組均按上述方法造模。各給藥組分別按梔子苷33.2 μg/ml、三七總皂苷22 μg/ml、通絡(luò)救腦注射液55.2 μg/ml的藥物濃度在造模前3 h以及造模過(guò)程中給藥，處理結(jié)束后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 western blotting法檢測(cè)各組微血管內(nèi)皮細(xì)胞BDNF的表達(dá)

用細(xì)胞刮收集各組內(nèi)皮細(xì)胞，在冰上用細(xì)胞破碎機(jī)破碎，離心后取上清，BCA 法檢測(cè)蛋白定量。配制聚丙烯酰胺凝膠，將變性蛋白樣品加入緩沖液，蛋白凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)，用5%的脫脂奶粉封閉PVDF膜上的蛋白潛在結(jié)合位點(diǎn)，分別加入一抗，4℃過(guò)夜，加入二抗后ECL試劑顯色、照相。

1.5 免疫熒光法檢測(cè)各組微血管內(nèi)皮細(xì)胞BDNF的表達(dá)

將各組微血管內(nèi)皮細(xì)胞在4%的多聚甲醛中固定10min，l% TritonX-100透化處理2～3 min，5%BSA封閉1 h后，加入5%BSA稀釋的一抗4℃過(guò)夜。5%BSA稀釋的熒光標(biāo)記的二抗于37℃孵育1 h。用ProLong Gold antirade reagent with DAPI抗淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 western blotting檢測(cè)BDNF的表達(dá)情況

圖1顯示，與正常組比較，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞擬缺血損傷后BDNF的表達(dá)量明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，梔子苷組BDNF的表達(dá)有所升高，但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；三七總皂苷組與通絡(luò)救腦注射液組BDNF的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 western blotting檢測(cè)BDNF的結(jié)果注：與正常對(duì)照組比較:*P<0.05；與模型組比較:# P<0.05

2.2 免疫熒光法檢測(cè)的BDNF的表達(dá)情況

圖2顯示，熒光顯微鏡下各組細(xì)胞BDNF表達(dá)均呈陽(yáng)性，淺色熒光顆粒主要位于胞漿，尤其是核周。正常組細(xì)胞胞體較大，淺色熒光相對(duì)較弱；模型組細(xì)胞回縮明顯，變得細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞間隙變大，熒光強(qiáng)度明顯變強(qiáng)；3個(gè)給藥組的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)，尤其是三七總皂苷組與通絡(luò)救腦注射液組增強(qiáng)明顯，結(jié)果與western blotting相一致。

3 討論

血管新生是指在原有血管基礎(chǔ)上通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、游走、芽生、血管分裂及分支而形成新的毛細(xì)血管網(wǎng)，使其功能與局部需要相適應(yīng)的生物學(xué)過(guò)程[5]。腦缺血中后期缺血半暗帶開(kāi)始出現(xiàn)血管新生，損傷部位新生的側(cè)支血管可以改善缺血區(qū)周圍的血液供應(yīng)，血管新生可能為神經(jīng)元的重構(gòu)提供了關(guān)鍵的神經(jīng)血管底物。研究表明，腦組織血管密度高的卒中患者預(yù)后明顯好于血管密度低的患者，腦血管新生可明顯改善缺血區(qū)周圍的組織灌注，彌補(bǔ)因血流量不足導(dǎo)致的腦損傷，縮小腦梗死體積，重塑神經(jīng)結(jié)構(gòu)，使神經(jīng)功能盡快盡可能恢復(fù)[6]。因此，促進(jìn)血管新生成為治療腦缺血的一條有效途徑。

圖2 免疫熒光法檢測(cè)BDNF的結(jié)果注：A.正常組；B.模型組；C.梔子苷組；D.三七總皂苷組；E.通絡(luò)救腦注射液組

BDNF是一類多功能的多肽因子，是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中的一員[7]，它廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括海馬、小腦、大腦皮質(zhì)等。BDNF除在神經(jīng)系統(tǒng)中起重要作用外，還在維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活、促進(jìn)缺血部位內(nèi)皮細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要作用，是一種重要的血管再生因子。研究顯示，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞患者血漿中BDNF水平明顯升高，可能與參與骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生有關(guān)[8]。王雅丹等[1]認(rèn)為，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通過(guò)AKT和ERK1/2信號(hào)通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，內(nèi)皮細(xì)胞擬缺血損傷后BDNF的表達(dá)較正常組明顯升高，提示氧糖剝奪的刺激啟動(dòng)了內(nèi)皮細(xì)胞的自修復(fù)機(jī)制，BDNF可能參與內(nèi)皮細(xì)胞的自修復(fù)。與模型組比較，梔子苷組BDNF的表達(dá)有所升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；三七總皂苷與通絡(luò)救腦注射液組比較，模型組BDNF的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，三七總皂苷與通絡(luò)救腦注射液對(duì)擬缺血內(nèi)皮細(xì)胞BDNF的表達(dá)具有顯著上調(diào)作用，這可能是其發(fā)揮血管保護(hù)和促進(jìn)血管新生作用的機(jī)制之一，但梔子苷在這一環(huán)節(jié)作用不明顯。

綜上所述，通絡(luò)救腦注射液可明顯提高缺血后內(nèi)皮細(xì)胞促血管再生性因子BDNF的表達(dá)，這對(duì)改善微血管再生環(huán)境、促進(jìn)腦缺血損傷后微血管的新生、從而有效恢復(fù)缺血區(qū)血液供應(yīng)具有重要意義，可能是該注射液發(fā)揮腦保護(hù)的內(nèi)在機(jī)制之一。2有效

組分中三七總皂苷對(duì)BDNF的表達(dá)有顯著上調(diào)作用，而梔子苷在上調(diào)BDNF環(huán)節(jié)作用不明顯，提示2組分在發(fā)揮促血管再生方面，三七總皂苷可能作用更為突出。

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