趙 燕，楊 明，金 新，馬 杰，崔建英，賈 曉，高 亢，孫一光

氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林雙重抗血小板治療是目前急性冠脈綜合征和冠心病患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI)后的常規(guī)治療方案。但部分患者即使接受常規(guī)抗血小板治療，臨床上仍不能有效防止血栓事件的發(fā)生，且不能有效抑制血小板聚集。其主要原因與氯吡格雷低反應(yīng)性有關(guān)。如何監(jiān)測血小板功能，進(jìn)行有效的危險(xiǎn)分層和預(yù)后評估，進(jìn)而實(shí)行抗血小板藥物的個(gè)體化治療已成為臨床亟待解決的問題。流式細(xì)胞術(shù)是目前常用且較穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)室血小板功能檢測方法，PAC-1 和CD62p是主要的血小板受體活化標(biāo)志物。CD62p的增加并不會(huì)隨著時(shí)間的延長而發(fā)生逆轉(zhuǎn),因此其被認(rèn)為是血小板功能檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”[1]。流式細(xì)胞術(shù)靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度均較高,但是費(fèi)用昂貴、操作復(fù)雜，臨床適用性不高。血栓彈力圖(TEG)是一種從凝血、血小板聚集、纖溶等方面動(dòng)態(tài)監(jiān)測凝血全過程的床旁快速血小板功能檢測方法。隨著臨床TEG在抗血小板聚集藥物療效監(jiān)測中的應(yīng)用，其對缺血事件的預(yù)測價(jià)值已得到證實(shí)，臨床上常以二磷酸腺苷(ADP)抑制率評估氯吡格雷的反應(yīng)性。本研究以流式細(xì)胞術(shù)為參考標(biāo)準(zhǔn)評估血小板功能，同時(shí)應(yīng)用TEG檢測的ADP抑制率評估氯吡格雷抗血小板聚集的治療效果，經(jīng)過1年的臨床隨訪，探討流式細(xì)胞術(shù)和TEG檢測對氯吡格雷反應(yīng)性的評估價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 入選2011年2—12月首都醫(yī)科大學(xué)附屬復(fù)興醫(yī)院心內(nèi)科收治住院，診斷為冠心病并行PCI，且術(shù)后行常規(guī)抗血小板治療并同意參與本研究的患者89例作為觀察組，其中男54例，女35例；年齡(67.8±11.2)歲。同時(shí)選取該院同期體檢健康者29例作為對照組，其中男16例，女13例；年齡(48.3±6.6)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有出血病史者；正在使用華法林或肝素抗凝治療者；正在服用非甾體類抗炎藥物者；肝功能不全〔門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT) 檢測>參考值(40 U/L)2倍以上〕者；腎功能不全(肌酐>140 μmol/L)者；患風(fēng)濕性疾病者；血小板計(jì)數(shù)<80×109/L或>450×109/L者；腫瘤或血液系統(tǒng)疾病者。兩組的性別構(gòu)成、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 0.754,t=0.421，P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)室檢查 患者入院即刻抽取肘靜脈血查白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、血紅蛋白(Hb)、血糖(GLU)、血鉀(K)、血鈉(Na)、血氯(Cl)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血尿酸(UA)、血腦利鈉肽(BNP)、凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、纖維蛋白原(Fgb)，記錄并錄入數(shù)據(jù)庫。

1.2.2 治療方法 觀察組患者在術(shù)后堅(jiān)持服用冠心病二級預(yù)防藥物，抗血小板藥物聯(lián)合應(yīng)用阿司匹林100 mg (1次/d)和氯吡格雷75 mg(1次/d)。

1.2.3 CD62p及PAC-1的檢測 患者均在行冠狀動(dòng)脈造影PCI后第7天晨起空腹抽取肘靜脈血5 ml置于109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝真空管(美國BD公司)中，并取5 μl血分別加入事先置有單抗(美國BD公司產(chǎn))的塑料管內(nèi)，其中對照管含CD61Per-CP、鼠抗人IgM-FITC、鼠抗人IgG 1-PE各20 μl，實(shí)驗(yàn)管含CD61Per-CP、鼠抗人IgM-FITC、鼠抗人IgG 1-PE、CD62-PE各20 μl。兩管均室溫避光反應(yīng)20 min，每管分別加入1 ml含1%多聚甲醛的PCS固定20 min，置于4 ℃冰箱保存，并于24 h內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickin公司)檢測血小板膜糖蛋白CD62p及PAC-1的表達(dá)率〔CD62p(GMP·140)、PAC-1檢測均用5 μmol/L二磷酸腺苷誘導(dǎo)〕。對照組晨起抽取肘靜脈血5 ml 置于109 mmol/L 枸櫞酸鈉抗凝真空管(美國BD公司)，2 h內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickin 公司)檢測血小板膜糖蛋白CD62p及PAC-1的表達(dá)率。

1.2.3 ADP抑制率的檢測 用含109 mmol/L的枸櫞酸鈉0.4 ml抗凝的真空采血管和肝素鈉真空采血管分別采血2.7 m1和3.0 ml，3 h內(nèi)應(yīng)用TEG@5000(美國Haemoscope公司產(chǎn))檢測ADP抑制率。試劑包括：花生四烯酸(AA)、ADP、激活劑F(由蝮蛇血凝酶和血小板XⅢa因子混合而成)、高嶺土(含1%kaolin液)。

1.2.4 出血分級標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)血流分級(TIMI)出血評分標(biāo)準(zhǔn)[2]進(jìn)行分級，主要出血：顱內(nèi)出血或臨床可見的出血(包括影像學(xué))，伴Hb水平下降>50 g/L；小出血：臨床可見的出血(包括影像學(xué))，伴Hb水平下降30～50 g/L；輕微出血：臨床可見的出血(包括影像學(xué))，伴Hb水平下降<30 g/L。

1.3 觀察指標(biāo) 流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板活化標(biāo)志物PAC-1 和CD62p受體表達(dá)量，TEG檢測反映氯吡格雷效果的ADP抑制率，同時(shí)隨訪患者1年內(nèi)缺血事件和出血事件發(fā)生率。

2 結(jié)果

2.1 觀察組患者臨床資料 觀察組患者臨床資料詳見表1。

表1 患者臨床資料(n=89)Table 1 The clinical data of patients

注：WBC=白細(xì)胞計(jì)數(shù)，Hb=血紅蛋白，GLU=血糖，K=鉀離子，Na=鈉離子，Cl=氯離子，BUN=尿素氮，Scr=血肌酐，UA=血尿酸，BNP=腦利鈉肽，PT=凝血酶原時(shí)間，APTT=活化部分凝血活酶時(shí)間，F(xiàn)gb=纖維蛋白原,PLT=血小板計(jì)數(shù)

2.2 氯吡格雷反應(yīng)性判斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)四分位數(shù)間距法,計(jì)算出血小板活化標(biāo)記物表達(dá)量,定義血小板活化標(biāo)記物CD62p>15.5%同時(shí)PAC-1>3.01%為血小板活化程度高表達(dá)，代表氯吡格雷反應(yīng)性較低；血小板活化標(biāo)記物CD62p>15.5%或者PAC-1>3.01%為血小板活化程度中等表達(dá)；血小板活化標(biāo)記物CD62p<15.5%或者PAC-1<3.01%為血小板活化程度低表達(dá)，代表氯吡格雷反應(yīng)性較好。

2.3 ADP抑制率與CD62p、PAC-1表達(dá)率擬合度 以流式細(xì)胞術(shù)檢測的CD62p、PAC-1反應(yīng)血小板功能，參考國外Godino等[3]研究中采用統(tǒng)計(jì)學(xué)四分位數(shù)間距法定義，兩者表達(dá)率均明顯增高(以CD62p>15.5%和PAC-1>3.01%定義為氯吡格雷反應(yīng)性低即血小板高反應(yīng)性)，評估TEG檢測方法，當(dāng)ADP抑制率為38.9%時(shí)靈敏度為97.0%、特異度為61.1%，ROC曲線下的面積為0.932(P=0.001，見圖1)。

圖1 ADP抑制率診斷氯吡格雷低反應(yīng)性的ROC曲線Figure 1 ROC curve of ADP inhibition rate for diagnosis of clopidogrel low reactivity

2.4 PAC-1表達(dá)率與ADP抑制率的比較 血小板活化程度高表達(dá)患者有46例，中等表達(dá)患者43例，無低表達(dá)患者(見圖2)。結(jié)合ADP抑制率<38.9%，40例患者氯吡格雷反應(yīng)性較低。

圖2 PAC-1表達(dá)率與ADP抑制率的比較Figure 2 Comparison of the expression inhibition rate of PAC-1 and ADP

2.5 CD62p表達(dá)率與ADP抑制率的比較 血小板活化標(biāo)記物CD62p>15.5%同時(shí)PAC-1>3.01%的血小板活化程度高表達(dá)患者46例，中等表達(dá)患者43例，無低表達(dá)患者(見圖3)。結(jié)合ADP抑制率<38.9%，40例患者氯吡格雷反應(yīng)性較低。

2.6 患者隨訪結(jié)果 反應(yīng)性較低的患者與反應(yīng)性中等的患者缺血事件發(fā)生率和出血事件發(fā)生率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。所有隨訪患者僅4例發(fā)生輕微出血，主要表現(xiàn)為局部皮下出血、牙齦出血和眼底出血。

圖3 CD62p表達(dá)率與ADP抑制率的比較Figure 3 Comparison of the expression inhibition rate of CD62p and ADP

3 討論

阿司匹林和氯吡格雷雙重抗血小板治療是目前接受PCI和/或急性冠脈綜合征患者的標(biāo)準(zhǔn)治療[4]。然而，盡管在PCI后服用阿司匹林和氯吡格雷，1.0%～1.9%患者仍可能會(huì)發(fā)生急性或亞急性支架內(nèi)血栓形成[5]。有研究認(rèn)為，氯吡格雷的低反應(yīng)患者發(fā)生心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)增加了20%[6-7]。此外，有數(shù)據(jù)表明，支架置入后1個(gè)月內(nèi)的氯吡格雷低反應(yīng)性可以預(yù)測不良心血管事件[8]。冠心病患者行PCI后需長期服用抗血小板藥物，但服用雙聯(lián)抗血小板藥物仍然有患者發(fā)生心腦血管再次缺血[9]，還有患者在服用藥物期間因各種原因發(fā)生出血并發(fā)癥。因此，在臨床環(huán)境中探索患者對服用抗血小板藥物的反應(yīng)是目前全世界心血管臨床醫(yī)生共同面臨的難題[10]。

本研究通過檢測行PCI患者術(shù)后1周服用雙聯(lián)抗血小板藥物血小板活化標(biāo)記物的表達(dá)率及血小板ADP抑制率，以探索TEG檢測氯吡格雷的反應(yīng)性，并尋找能在臨床應(yīng)用中相對準(zhǔn)確地反映患者血小板功能狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)室檢查方法及判定范圍。

本研究連續(xù)觀察了89例同意參加本試驗(yàn)并行PCI的冠心病患者89例，年齡67～79歲，為高齡患者；其中糖尿病患者39例(43.8%)，血管病變?yōu)槿Щ蜃笾鞲?三支病變53例(59.6%)，行3枚及以上支架24例(26.9%)。本研究發(fā)現(xiàn)，按照血小板活化標(biāo)記物CD62p、PAC-1用統(tǒng)計(jì)學(xué)四分位數(shù)間距法界定的氯吡格雷反應(yīng)性較低患者有40例(44.9%)，與目前文獻(xiàn)報(bào)道的氯吡格雷低反應(yīng)性發(fā)生率波動(dòng)在5%～44%相近[11]，可能與本研究連續(xù)入選的為高齡患者，且復(fù)雜病變、多支病變發(fā)生率>50%，糖尿病患者的比例較高有關(guān)[12]。經(jīng)過1年的臨床隨訪觀察，氯吡格雷反應(yīng)性較低的40例患者中有1例行PCI后1年內(nèi)行冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)，同時(shí)有1例患者死亡,3例因嚴(yán)重心臟缺血致心律失常、心絞痛等再入院；與氯吡格雷反應(yīng)中等的49例患者相比，前者在缺血事件上相對增多,但兩組缺血事件發(fā)生率無明顯差異，可能與本研究樣本數(shù)量較少有關(guān)。此外，氯吡格雷反應(yīng)性較低患者較氯吡格雷反應(yīng)性中等患者的輕微出血率低，但兩組無明顯差異。以上結(jié)果提示，對高齡、高危冠心病患者進(jìn)行TEG監(jiān)測有一定臨床意義，但因本研究樣本量較少，結(jié)果可能存在偏倚，提示今后可繼續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。

本研究通過TEG檢測患者ADP抑制率[13]，反映患者對氯吡格雷的反應(yīng)性。結(jié)果顯示，當(dāng)ADP抑制率為38.9%時(shí)，靈敏度為97.0%、特異度為61.1%、ROC曲線下面積為0.932。臨床檢驗(yàn)科提示TEG檢測的ADP抑制率>50%為藥物反應(yīng)良好,如果<20%說明血小板對藥物反應(yīng)性差，因此本研究以ADP抑制率<38.9%可以較準(zhǔn)確地反映患者對氯吡格雷的反應(yīng)性較低，若按照<20%界定就可能漏掉一些高?；颊?，所以繼續(xù)擴(kuò)大樣本延長隨訪時(shí)間有助于更準(zhǔn)確地反映患者對抗血小板藥物的反應(yīng)性。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板活化標(biāo)記物CD62p、PAC-1表達(dá)率與TEG檢測ADP抑制率的比較顯示，血小板活化標(biāo)記物CD62p>15.5%同時(shí)PAC-1>3.01%的血小板活化程度高表達(dá)患者46例，中等表達(dá)患者43例，無低表達(dá)患者。結(jié)合ADP抑制率<38.9%，40例患者氯吡格雷反應(yīng)性較低。因此，與較昂貴且繁瑣的流式細(xì)胞術(shù)相比，臨床應(yīng)用TEG檢測可以監(jiān)測對氯吡格雷反應(yīng)性較低的患者，進(jìn)而降低心腦血管事件(死亡、非致命性心肌梗死、再次血運(yùn)重建、腦卒中)發(fā)生率。

表2 患者1年缺血事件和出血事件的隨訪結(jié)果〔n(%)〕Table 2 Follow up of the patients with 1 years of ischemic events and bleeding events

注：-表示無此數(shù)據(jù)

PCI后再狹窄是困擾醫(yī)師與患者的主要問題，強(qiáng)化抗血小板治療并不能對每位患者起到良好效果。日本、韓國的幾項(xiàng)臨床研究提示，氯吡格雷無反應(yīng)性或反應(yīng)性低下的發(fā)生率為4%～40%[14-15]。目前臨床研究提示，加大首次負(fù)荷劑量甚至給予兩次負(fù)荷劑量可以提高氯吡格雷的抗血小板作用[16]。也有研究認(rèn)為，合用替羅非班可以降低選擇性PCI后的心肌梗死發(fā)生率[17]。對氯吡格雷反應(yīng)性差異的研究仍在探索中，全世界心血管醫(yī)生正努力尋找解決方案。有研究提示，新型抗血小板藥物替格瑞洛可能是解決對氯吡格雷反應(yīng)性低下患者的另一類機(jī)制藥物，但仍需要臨床研究證實(shí)。

綜上所述，TEG檢測冠心病患者行PCI后對氯吡格雷低反應(yīng)性的ADP抑制率<38.9%，提示患者對藥物可能存在抵抗，在臨床工作中需關(guān)注這部分患者，以降低患者心腦血管事件的發(fā)生率。

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