孫曉艷，王亞帝，何東寧，李 萍，哈敏文

腫瘤細胞對化療的敏感性和耐受性存在個體差異，可能是導致化療失敗、病情進展的重要原因。目前，國內(nèi)外已對非小細胞肺癌(NSCLC)相關的多種化療預后因子進行了研究，為NSCLC的分子分型及個體化治療提供了實驗依據(jù)，但有些預后因子的特異性并未達到理想的效果，研究結(jié)果仍存在爭議，如BAG-1蛋白。BAG-1蛋白能與多種基因蛋白產(chǎn)物相作用，調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡。BAG-1基因編碼的產(chǎn)物BAG-1蛋白有4個異構體，均是由1條mRNA鏈通過選擇性剪切翻譯而成的，其中3個主要的異構體是BAG-1L、BAG-1M和BAG-1S蛋白。BAG-1蛋白雖是抗凋亡蛋白，但其對預后的意義有一定爭議，認為與BAG-1蛋白的優(yōu)勢亞型有關。王慧等[1]研究發(fā)現(xiàn)在大腸癌中BAG-1L蛋白表達水平越高，其惡性程度越高，臨床預后越差；Millar等[2]認為浸潤性導管癌的核型BAG-1蛋白即BAG-1L蛋白的高表達提示局部復發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移率低，其預后較好；Rorke等[3]研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC細胞質(zhì)中BAG-1蛋白的高表達與患者生存期的延長相關。環(huán)氧化酶-2(COX-2)蛋白在多種腫瘤組織中高表達，能促進癌細胞的增殖，延緩凋亡，致使癌癥患者預后較差。郭琰[4]通過對胃癌細胞的研究發(fā)現(xiàn)COX-2蛋白能夠激活上調(diào)Bcl-2蛋白的表達。BAG-1蛋白促進抗細胞凋亡的能力也是通過與Bcl-2形成復合物并上調(diào)Bcl-2蛋白的表達，最終使生存期延長。BAG-1與COX-2蛋白可能通過某種通路影響NSCLC的預后。

本研究采用免疫組化法和RT-PCR技術檢測BAG-1蛋白的不同亞型及COX-2蛋白在NSCLC中的表達，探討NSCLC的BAG-1預后優(yōu)勢亞型，探討聯(lián)合檢測BAG-1與COX-2蛋白的表達對NSCLC預后的指導意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年1月—2010年1月于遼寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院行肺癌手術且術后行6～8個周期化療的120例NSCLC患者的手術病理標本，其中男62例，女58例，年齡45～76歲，中位年齡66歲；鱗癌54例，腺癌66例；高分化癌46例，中分化癌31例，低分化癌43例；按臨床術后外科病理分期(p-TNM)分為Ⅰ期22例、Ⅱ期42例、Ⅲ期56例(美國癌癥聯(lián)合委員會2002年分期標準)；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者45例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者75例。從化療結(jié)束開始每3個月對患者行電話隨訪1次，隨訪截止日期為2013年6月。根據(jù)臨床隨訪資料進行回顧性研究，分析BAG-1S和COX-2蛋白表達與性別、年齡、病理類型、分化程度、病理分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關系。

1.2 BAG-1蛋白和COX-2蛋白表達的檢測 采用免疫組化法檢測BAG-1蛋白和COX-2蛋白的表達，鼠抗BAG-1多克隆抗體(CC9E8，工作稀釋度為1∶15)購自Santa Cruz，兔抗COX-2多克隆抗體工作液、SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術公司。按SP免疫組化試劑盒說明書進行操作。

1.3 BAG-1S mRNA表達的檢測 采用石蠟包埋組織提取RNA及RT-PCR方法檢測BAG-1S mRNA的表達。石蠟包埋組織40 μm，EASY spin石蠟包埋組織RNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司(目錄號 RN30)，PrimeScript RT-PCR Kit購自大連寶生物工程有限公司(DRR014A)。

1.4 結(jié)果判定 BAG-1蛋白和COX-2蛋白表達：于免疫染色最多的區(qū)域計數(shù)1 000個肺癌細胞，觀察細胞著色程度，計算其陽性細胞百分數(shù)。著色強度評分：無色(-)為0分，淺黃色(+)為1分，棕黃色(++)為2分，深棕色(+++)為3分；陽性細胞百分數(shù)評分：0為0分，<25 %為1分，26 %～50 %為2分，51 %～75 %為3分，76 %～100 %為4分。細胞著色強度與陽性細胞百分數(shù)得分之和≥3分即為免疫組化染色陽性。PCR產(chǎn)物：10 μl擴增產(chǎn)物在1 % 瓊脂糖(Agarose)凝膠(含有EB)中150 V電泳30 min，同時以5 μl標準分子量DNA Marker 2 000 bp作為參照，電泳結(jié)束后，紫外燈下觀察結(jié)果并照相。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，率的比較采用χ2檢驗；BAG-1S和COX-2蛋白表達的相關性采用Spearman秩相關分析；繪制生存曲線，生存數(shù)據(jù)的分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗；采用Cox回歸模型進行生存期的多因素分析，納入的自變量為年齡、性別、病理類型、分化程度、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、BAG-1S蛋白表達和COX-2蛋白表達；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，均為雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 BAG-1蛋白和COX-2蛋白表達 BAG-1蛋白在胞質(zhì)及胞核均有表達，共有103例陽性表達，單獨在胞質(zhì)表達41例，單獨在胞核表達12例，在胞質(zhì)和胞核同時表達50例。COX-2蛋白主要在胞質(zhì)表達，共有67例陽性表達，陽性表達率為55.8%(見圖1～6)。

2.2 RT-PCR產(chǎn)物 BAG-1S mRNA陽性表達73例，陽性表達率為60.8%(見圖7)。

圖7 BAG-1S mRNA陽性表達Figure 7 The positive expression of BAG-1S mRNA

2.3 BAG-1S蛋白和COX-2蛋白表達與臨床特征的關系 不同分化程度NSCLC患者BAG-1S蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.551，P=0.005)；不同病理類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者COX-2蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.069、7.320，P=0.003、0.007，見表1)。

圖1 BAG-1蛋白在胞質(zhì)表達(SP法，×400)
Figure1 BAG-1 protein expression in the cytoplasm

圖2 BAG-1蛋白在胞質(zhì)、胞核同時表達(SP法，×400)
Figure2 BAG-1 protein expression in the cytoplasm and the nucleus

圖3 BAG-1蛋白在胞核表達(SP法，×400)
Figure3 BAG-1 protein expression in the nucleus

圖4 BAG-1蛋白表達陰性對照(SP法，×400)
Figure4 BAG-1 protein expression in the negative control

圖5 COX-2蛋白在胞質(zhì)表達(SP法，×400)
Figure5 COX-2 protein expression in the cytoplasm

圖6 COX-2蛋白在胞核表達(SP法，×400)
Figure6 COX-2 protein expression in the nucleus

表1 不同臨床特征患者BAG-1S和COX-2蛋白陽性表達率比較〔n(%)〕Table 1 Comparison of BAG-1S and COX-2 protein positive expression rate in patients with different characteristics

2.4 生存曲線比較 BAG-1S蛋白陽性表達、BAG-1L/M蛋白陽性表達、BAG-1蛋白陰性表達患者的總生存期(OS)、無進展生存期(PFS)分別為39.482、36.414、35.806個月，25.760、24.235、23.925個月。BAG-1S蛋白陽性表達、BAG-1L/M蛋白陽性表達、BAG-1蛋白陰性表達患者的OS、PFS比較，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=37.191、35.051，P<0.001)，BAG-1L/M蛋白陽性表達與BAG-1蛋白陰性表達患者的OS、PFS比較，差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=1.220、1.209，P=0.269、0.272，見圖8、9)。

COX-2蛋白陽性與陰性表達患者的OS(37.671、39.007個月)、PFS(24.861、25.520個月)比較，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=4.605、4.232，P=0.032、0.040，見圖10、11)。

BAG-1S、COX-2蛋白單獨陽性表達及二者同時表達的OS(41.516、35.948、38.330個月)、PFS(26.805、24.056、25.173個月)比較，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=31.246、28.442，P<0.001，見圖12、13)。

圖8注：OS=總生存期

圖8 BAG-1不同亞型蛋白表達患者的OS曲線
Figure8 OS curves of patients in BAG-1 protein expression with different subtypes

圖9注：PFS=無進展生存期

圖9 BAG-1不同亞型蛋白表達患者的PFS曲線
Figure9 PFS curves of patients in BAG-1 protein expression with different subtypes

圖10 COX-2蛋白陽性表達與陰性表達患者的OS曲線
Figure10 OS curves of patients in COX-2 positive expression or not

圖11 COX-2蛋白陽性表達與陰性表達患者的PFS曲線
Figure11 PFS curves of patients in COX-2 positive expression or not

圖12 BAG-1S、COX-2各自陽性表達及二者同時陽性表達患者的OS曲線
Figure12 OS curves of patients in BAG-1S,COX-2 respectively positive expression and both are positive expression

圖13 BAG-1S、COX-2各自陽性表達及二者同時陽性表達患者的PFS曲線
Figure13 PFS curves of patients in BAG-1S,COX-2 respectively expression and both are positive expression

2.5 Spearman秩相關分析 BAG-1S蛋白與COX-2蛋白的表達呈正相關(r=0.180，P=0.049)。

2.6 Cox回歸分析 Cox回歸分析顯示BAG-1S蛋白、COX-2蛋白、分化程度、病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是NSCLC患者生存期的影響因素(見表2)。

表2 NSCLC患者生存期的Cox回歸分析Table 2 Cox regression analysis of survival time for NSCLC patients

3 討論

病理組織分型曾是預測NSCLC治療效果的重要指標。但目前隨著分子生物學及遺傳學的進展，逐漸認識到腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅在病理，而且在遺傳及基因表型等方面同樣具有異質(zhì)性，目前結(jié)合分子生物學標記等預測指標，已成為指導NSCLC臨床個體化治療及預測療效的重要研究方向。

BAG-1基因是一種抗凋亡基因，其編碼產(chǎn)物能與多種基因蛋白產(chǎn)物相互作用，調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡。BAG-1蛋白在多種惡性腫瘤中高表達，但表達的意義不盡相同[5-10]。Dzhagalov 等[11]發(fā)現(xiàn) BAG-1蛋白表達陰性的肺癌患者PFS和OS明顯延長。但Rorke等[3]研究發(fā)現(xiàn)，BAG-1蛋白陽性表達組患者的PFS及5 年生存率均高于陰性表達組?？紤]可能與BAG-1蛋白的優(yōu)勢亞型有關，不同亞型的BAG-1蛋白過表達在細胞中的分布與腫瘤患者預后之間的關系仍有爭議。Rorke等[3]發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)中BAG-1蛋白表達情況與較長的OS相關。而汪小沅[12]得出的結(jié)論與Rorke相反，其認為腫瘤胞核中BAG-1蛋白的過表達與死亡風險減低相關。本研究發(fā)現(xiàn)BAG-1蛋白在NSCLC中高表達，其中BAG-1S蛋白是NSCLC患者的預后優(yōu)勢亞型，可以延長患者的預后生存期，而BAG-1L/M蛋白對患者的預后無影響，BAG-1L/M蛋白陽性表達者的期與陰性表達者間無明顯差異，年齡、性別、病理類型、病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對BAG-1S蛋白的表達無影響。

BAG-1基因是抗凋亡基因,理論上該蛋白的高表達會導致患者的預后較差,而部分研究的結(jié)論恰恰相反,對于這一矛盾，Dzhagalov等[11]推測可能與不同個體內(nèi)BAG-1不同亞型蛋白的表達有關。這種矛盾關系在Bcl-2的抗凋亡活動中同樣存在[13]。本研究發(fā)現(xiàn)BAG-1S蛋白在NSCLC組織中高表達，是NSCLC患者的預后優(yōu)勢亞型，但其具體作用機制有待于進一步研究。

大量研究表明COX-2蛋白在大多數(shù)腫瘤中高表達，Jiang等[14]通過Meta分析得出COX-2蛋白的表達狀態(tài)是NSCLC的獨立預后因素，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后有關。COX-2蛋白在細胞周期調(diào)控中起重要作用，其過表達會抑制細胞分裂。研究發(fā)現(xiàn)其過表達與腫瘤侵襲性和不良預后有關[15-16]。本研究結(jié)果顯示：COX-2蛋白在NSCLC中高表達，病理類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能是其表達的影響因素，而其陰性表達患者的預后生存期明顯長于陽性表達者。

本研究顯示：BAG-1S與COX-2蛋白在NSCLC中的表達呈正相關，BAG-1S蛋白、COX-2蛋白、分化程度、病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對患者的生存期有影響。BAG-1S及COX-2蛋白同時陽性表達的患者生存期明顯長于單獨COX-2蛋白陽性表達者，但低于單獨BAG-1蛋白陽性表達者。吳倩等[17]、Wang等[18]和 Liu等[19]報道，BAG-1基因在NSCLC中的表達可能與鉑類藥物的化療敏感性相關。本研究患者均接受化療藥物治療，可能導致BAG-1S及COX-2蛋白對化療藥物的敏感性增加。

BAG-1基因是抗凋亡基因，但本研究發(fā)現(xiàn)BAG-1S蛋白陽性表達具有生存優(yōu)勢，可能是其對化療藥物敏感所致；COX-2蛋白同樣具有重要的預后作用。BAG-1S及COX-2蛋白既是預后的獨立影響因素，又能相互作用影響。因此，在腫瘤的臨床治療中，可以聯(lián)合檢測BAG-1S、COX-2蛋白預測NSCLC預后，又可以根據(jù)兩因子的相互關系指導臨床個體化治療，延長患者的生存時間。

本研究未對BCL-2蛋白進行檢測，今后的研究中將對BAG-1S及COX-2相關通路進行研究，并研究BAG-1S的作用機制。

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