周金章 綜述 龍孝斌 審校

斑馬魚(danio rerio)屬鯉科、輻鰭亞綱、短擔尼魚屬，原產(chǎn)于印度等地水域。斑馬魚體型纖細，成魚體長約3～5 cm,壽命2～3年；其胚胎及早期幼魚通體透明，生殖周期短、繁殖能力強,且基因與人類基因約87%相似。鑒于斑馬魚以上生物學特性，耳科學研究者亦采用斑馬魚模型探討毛細胞再生、遺傳性聾機制、耳毒性和抗耳毒性藥物篩查等。為此，本文對近年來斑馬魚模型用于內(nèi)耳科學領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀及進展綜述如下。

1 斑馬魚內(nèi)耳與側(cè)線系統(tǒng)解剖

斑馬魚雖無外耳和中耳，但具脊椎動物之典型內(nèi)耳解剖結(jié)構(gòu)。斑馬魚內(nèi)耳由三個半規(guī)管(前、后和水平半規(guī)管)、耳石器官(橢圓囊、球囊和聽壺)組成；半規(guī)管、橢圓囊主要行前庭平衡功能，而球囊及聽壺則司聽覺感知功能。除內(nèi)耳外，斑馬魚還具有另一感覺神經(jīng)器官—側(cè)線系統(tǒng)，其由大量單個神經(jīng)丘組成，每個神經(jīng)丘中央包含一簇由神經(jīng)支配的感覺毛細胞，其功能為探測自身局部水流及低頻振動、調(diào)節(jié)諸如學習、逃避及撲食等行為[1]。由于側(cè)線毛細胞與內(nèi)耳毛細胞功能及分子結(jié)構(gòu)極為相似且便于活體觀察及干預，現(xiàn)已廣泛用于毛細胞發(fā)育、再生、聽覺及前庭功能障礙研究[2]。

2 斑馬魚毛細胞損傷與再生研究

2.1斑馬魚毛細胞損傷模型的建立 類似哺乳動物，斑馬魚對氨基糖苷類抗生素及順鉑等耳毒性藥物有類似敏感性。Harris等[3]利用新霉素損傷斑馬魚幼魚側(cè)線毛細胞，通過5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)標記顯示，毛細胞損傷后48小時可觀察到大量有標記的增殖細胞，此種利用耳毒性藥物浸泡幼體斑馬魚損傷其毛細胞的方法簡便有效，是目前研究斑馬魚毛細胞損傷的最常用方法；Schuck等[4]應(yīng)用連續(xù)噪聲刺激建立斑馬魚內(nèi)耳毛細胞損傷模型并觀察毛細胞改變；而Uribe等[5]則采用慶大霉素腹腔注射法建立成年斑馬魚內(nèi)耳毛細胞損傷模型，亦取得滿意效果。

2.2斑馬魚再生毛細胞的來源 已知哺乳動物耳蝸毛細胞缺乏再生能力，前庭感覺上皮細胞再生能力有限，而再生的毛細胞可能來源于前體干細胞[6]；相反，部分非哺乳脊柱動物如鳥類、兩棲類及魚類，其毛細胞損傷后具有較強的再生能力；研究表明，鳥類支持細胞是再生毛細胞的來源且存在兩種再生方式，即直接分化(損傷早期)和分裂增殖[7]； Hernandez等[8]采用綠色熒光蛋白(GFP)標記的SqET4 和 SqET20轉(zhuǎn)基因斑馬魚研究發(fā)現(xiàn)，其側(cè)線毛細胞在損傷后也存在與鳥類相似的再生方式，且再生毛細胞大多來源于表達Sox2(sex determining region Y related high mobility group box-2,SKY related HMG box-2)的前體細胞；Mackenzie等[9]采用新霉素、順鉑和硫酸銅等作用于側(cè)線毛細胞，并應(yīng)用氟苯達唑抑制細胞增殖后提示，支持細胞增殖對毛細胞再生過程起主要作用；而Ma等[10]研究發(fā)現(xiàn)，損傷后再生的毛細胞主要由側(cè)線神經(jīng)丘中央群的支持細胞分裂而來。

2.3參與斑馬魚毛細胞再生的基因及信號通路 與小鼠模型相似，斑馬魚atoh1基因(人類Math1的同源基因)也是維持毛細胞分化和發(fā)育所必需的，過表達atoh1也可產(chǎn)生大量毛細胞[11]；既往哺乳動物模型研究認為Sox2可維持多能干細胞的潛能或涉及早期細胞分化，Millimaki等[12]通過斑馬魚模型研究發(fā)現(xiàn)，Sox2具有維持毛細胞生存及再生過程中支持細胞直接轉(zhuǎn)化為毛細胞的功能；Lin等[13]研究發(fā)現(xiàn)，阻斷視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)基因與Raf-1蛋白激酶的交互作用可阻斷RB的磷酸化，進而阻礙斑馬魚側(cè)線支持細胞增殖再生為毛細胞；Schuck等[14]則通過基因微陣列研究分析認為，斑馬魚內(nèi)耳毛細胞在聲損傷后生長激素的表達顯著上調(diào)，而通過腹腔注射人工合成的生長激素可促進內(nèi)耳毛細胞顯著增殖。

近年研究認為，Notch信號通路存在于毛細胞再生過程中。在斑馬魚側(cè)線系統(tǒng)，Notch信號通路成員(notch3,deltaA,atoh1a)在氨基糖苷類抗生素誘發(fā)毛細胞損傷后24小時內(nèi)表達上調(diào)，此時支持細胞分裂活躍且新生毛細胞開始形成[10]；Liang等[15]利用數(shù)字化基因表達技術(shù)發(fā)現(xiàn)信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator transcription,stat3)/細胞因子信號傳導抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,socs 3)(stat3/socs3)通路可調(diào)節(jié)斑馬魚毛細胞再生過程，且和哺乳動物模型一樣，該通路也存在嚴格負反饋調(diào)節(jié)；最新研究提示W(wǎng)nt/beta-catenin信號通路也參與斑馬魚毛細胞再生調(diào)控，即活化Wnt信號可以促進神經(jīng)丘內(nèi)靜止成熟的支持細胞重新進入增殖狀態(tài)，而過表達dkk1b(Wnt信號抑制劑)則可抑制包括細胞分化和再生形式的增殖[16]。

3 斑馬魚在遺傳性聾中的應(yīng)用

3.1遺傳性聾斑馬魚模型 據(jù)統(tǒng)計，我國新生兒極重度聾發(fā)病率約為1/1 000，其中50%以上與遺傳因素有關(guān)[17]。2000年Ernest等[18]首先報道斑馬魚mariner突變體可出現(xiàn)內(nèi)耳毛細胞束異常、內(nèi)耳微音器電位減弱等，此形態(tài)及功能缺陷與編碼異常肌球蛋白7a(myosin Ⅶa)小鼠shaker-1突變體極為類似；研究[19]發(fā)現(xiàn)，grhl2bT086突變系斑馬魚表現(xiàn)為聽泡擴大、耳石變小及半規(guī)管畸形，但其毛細胞發(fā)育正常，而注射人工合成野生型斑馬魚grhl2b、人類grhl2或小鼠grhl2(grainyhead-like 2)mRNA則可拯救突變表型，表明grhl2bT086突變斑馬魚品系為研究人類DFNA28漸進性聽力損失的理想動物模型。此外可用于遺傳性聾的斑馬魚模型還包括eyal、colorless 、sputnik等。

3.2遺傳性聾發(fā)生機制 經(jīng)過近二十年努力，目前已鑒定出64個遺傳性聾基因[20]，但部分新穎基因并不能解釋聽力損失的細胞或分子機制。Busch-Nentwich等[21]對斑馬魚同源基因DFNA5研究發(fā)現(xiàn)，該基因與尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶[uridinc 5’-diphos phate(UDP)-glucose dehyrogenase,Ugdh]的表達密切相關(guān)，而后者是細胞外基質(zhì)透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)形成的關(guān)鍵酶，故推測DFNA5的表達產(chǎn)物主要扮演細胞外基質(zhì)的角色；轉(zhuǎn)錄因子sox10突變與Waardenburg 綜合癥相關(guān)，但其調(diào)控機制仍不明確，Dutton等[22]通過體內(nèi)檢測斑馬魚DNA片段聯(lián)合比較基因組學的方法認為， Tcf/Lef、Sox及FoxD3等轉(zhuǎn)錄因子靶位點可促進sox10在神經(jīng)嵴及內(nèi)耳上皮表達；Riazuddin等[23]對耳聾家系研究發(fā)現(xiàn)CIB2突變可導致人類非綜合型DFNB48遺傳性聾，此基因可編碼Ca2+及整合素結(jié)合蛋白，通過嗎啉環(huán)修飾的寡核苷酸(morpholinos，MOs)抑制斑馬魚CIB2的表達，導致斑馬魚神經(jīng)丘發(fā)育缺損、毛細胞微音器電位減弱；Yariz等[24]通過全外顯子組測序發(fā)現(xiàn)，OTOGL基因可編碼耳膠蛋白類似物，而MOs抑制OTOGL表達后，導致斑馬魚內(nèi)耳解剖結(jié)構(gòu)異常及感音性聽力損失。

4 斑馬魚用于藥物篩查研究

4.1耳毒性藥物篩查 耳毒性藥物主要導致聽覺毛細胞損傷甚至消失，但因缺少簡便有效的聽覺評價模型，臨床批準上市的藥物多無耳毒性評估指標。2005年Ton等[25]首次應(yīng)用斑馬魚模型評估藥物耳毒性效應(yīng)，并初步建立了斑馬魚藥源耳毒性模型；隨后Chiu等[26]利用斑馬魚藥源模型篩查了FDA批準上市的1 040余種藥物，結(jié)果提示21種為耳毒性化合物，包括斯伐他汀、坎地沙坦、長春胺等；2011年，Hirose等[27]對美國國家癌癥研究所批準的88種抗腫瘤藥物進行篩查，提示13種藥物具有耳毒性，包括已知的藥物如順鉑、氮芥等及可疑的藥物如長春瑞濱、伊馬替尼、阿霉素等。

4.2抗耳毒性藥物篩查 既往文獻顯示，約50余種藥物對毛細胞具有保護作用且大多數(shù)藥物的保護作用并不完全。Owens等[28]采用新霉素建立斑馬魚藥物性耳毒性模型，并對10 960種類藥性小分子化合物進行篩查，提示PROTO-1、PROTO-2兩種苯并噻吩甲酰胺類化合物能拮抗新霉素的耳毒性損傷；Ou[29]和Vlasits[30]等分別篩選了FDA批準的部分藥物，發(fā)現(xiàn)他克林、它莫西芬和六氫芬寧等可拮抗部分氨基糖苷類抗生素的耳毒性損傷；Coffin等[31]采用側(cè)線神經(jīng)丘對61種已知的細胞死亡相關(guān)的分子靶點藥理抑制劑進行篩查，結(jié)果提示自噬抑制劑(3-MA)、絲氨酸蛋白酶抑制劑(FUT-175)和蛋白酶體抑制劑(Z-LLF-CHO)均可有效拮抗新霉素、慶大霉素及順鉑的耳毒性。

5 斑馬魚用于行為學研究

因斑馬魚體型小、便于觀察，通過其行為學特征可以簡潔、有效地分析聽覺、平衡感覺整合功能，如背光反應(yīng)、前庭眼動反射等可有效評價斑馬魚前庭功能；聽覺誘發(fā)驚恐反射存在與否可用來篩查聽覺功能缺陷的個體[32]；而趨流性實驗則可評價側(cè)線毛細胞功能[33]；在聽覺研究方面，Cervi等[34]首次利用行為學的方法描述了斑馬魚的聽覺功能，實驗采用食物獎賞與聲覺刺激相結(jié)合的方法探討斑馬魚聽覺敏感聲頻范圍，發(fā)現(xiàn)斑馬魚的行為聽覺敏度與訓練采用的聲刺激頻率高度相關(guān)。

目前，國內(nèi)有關(guān)聽覺及耳聾的斑馬魚模型研究尚處于起步階段，成年斑馬魚內(nèi)耳解剖、毛細胞分離和聽覺誘發(fā)電位測量技術(shù)已經(jīng)成熟，而隨著斑馬魚基因組計劃的進一步完善以及全球范圍內(nèi)更多斑馬魚研究實驗室的建立，斑馬魚模型在內(nèi)耳科學研究領(lǐng)域的應(yīng)用也將更加廣泛。

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