尹立平

(天津市寶坻區(qū)藥品檢驗所，天津301800)

細菌內毒素檢查法動態(tài)濁度法*

尹立平

(天津市寶坻區(qū)藥品檢驗所，天津301800)

查閱有關文獻資料，對細菌內毒素檢查法－動態(tài)濁度法的原理、試劑要求、實驗設計、試驗方法、應用等方面做一歸納，總結了選用實驗試劑注意問題、操作關鍵技巧、試驗步驟、建立標準曲線和回收率計算方法及其在藥品檢驗中的應用。

細菌內毒素檢查法，動態(tài)濁度法，內毒素，鱟試劑

細菌內毒素檢查法也稱鱟試驗法，用來判定供試品中內毒素含量的限量是否符合規(guī)定的分析方法。目前，國內外藥典收載的有凝膠法、濁度法和顯色法。2010年版《中國藥典》二部附錄中，將光度測定法中動態(tài)濁度法收載為測定內毒素含量的方法之一。

1 實驗原理

動態(tài)濁度法是由內毒素與鱟試劑的C因子反應，被激活的凝固酶切斷凝固原蛋白中的精氨酸肽鏈，形成凝固蛋白，在產生凝膠過程中發(fā)生濁度變化，用濁度儀檢測反應混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測濁度增加速度的方法。此方法靈敏度高，操作簡單，檢測范圍廣(0.006～300 EU/ml)。

2 試驗試劑

2.1 內毒素標準品細菌內毒素標準品是保證試驗的平行與重復性的重要參照標準物質，主要分為工作標準品CSE和國家標準品NS/RSE。日常檢驗時，一般均使用廉價的工作標準品。動態(tài)濁度定量法使用的內毒素標準品要求穩(wěn)定性好，效價準確，具有很好的重現性。內毒素標準品的稀釋過程操作是試驗關鍵，不正確操作會導致效價偏低，靈敏度標示偏高、陽性對照不凝等［1］。故而2010年《中國藥典》要求內毒素標準品溶解后，在旋渦混合器上混合15 min，以后每一步稀釋前最少混合30 s［2］。

2.2 鱟試劑內毒素檢查法結果準確度與所用鱟試劑的靈敏度關聯極大［3］，細菌內毒素檢查時不能使用靈敏度值高于限值的鱟試劑。動態(tài)濁度法應該選用定量法鱟試劑，要求最低檢測限0.03～0.005 EU/ml?，F在市售的美洲鱟試劑(縮寫為LAL)與東方鱟試劑(縮寫為TAL)，功效相同。國產定量專用TAL目前有KT、KTA系列。KTA最低檢測限達到0.005 EU/ml，可滿足于動態(tài)濁度法檢測需要。

2.3 細菌內毒素檢查用水試驗中鱟試劑的溶解、細菌內毒素標準品及供試品的稀釋都要用細菌內毒素檢查用水，不可以普通檢查用水代替。2010年版《中國藥典》明確要求動態(tài)濁度測定法所用細菌內毒素檢查用水內毒素含量小于0.005 EU/ml，且對內毒素試驗無干擾作用。

3 實驗設計

3.1 內毒素限值(L)的確定有兩種方法可以確定內毒素限值(L)［4］:①依《中國藥典》規(guī)定:《中國藥典》2010年版中有規(guī)定檢查細菌內毒素項的化學藥424個，生物制品39個品種的正文可以查到相應的L值。②根據人的最大注射劑量:計算公式為L=K/M，L為供試品的細菌內毒素限值(以EU/ml、EU/mg、EU/U表示)。K為人用按規(guī)定的給藥途徑不發(fā)生任何臨床不良反應時，每kg體重每h最大可接受的內毒素劑量，以EU/kg·h－1表示。靜脈(包括im，ip，SC，ia): 5.0 EU/kg·h－1;放射性藥品:2.5 EU/kg·h－1;鞘內: 0.2 EU/kg·h－1。M為人用每kg體重每h最大給藥劑量，以ml/kg·h－1、mg/kg·h－1、U/kg·h－1等表示，中國成人人均體重按60 kg計算，人體表面積按1.62 m2計算，注射時間小于1 h的按1 h計算。

3.2 最大有效稀釋倍數(MVD)藥品細菌內毒素檢查時，當內毒素限值L=A值(鱟試劑靈敏度)時，經干擾實驗證實無干擾，可以直接檢查。當L＞A值時，需要稀釋供試品，但稀釋的倍數不能超過最大有效稀釋倍數，用MVD表示。其計算公式為MVD=LC/λ，C為供試品溶液濃度，L為供試品的內毒素限值，λ為動態(tài)濁度法中所使用的標準曲線上最低的內毒素濃度。當L以EU/mg、EU/U表示時，C的單位為mg/ml、U/ml;當L以EU/ml表示時，C為1.0 EU/ml;當供試品為注射用無菌粉末或原料藥時，MVD=1，可計算供試品的最小有效稀釋濃度C=λ/L。

3.3 標準曲線的可靠性試驗當試驗條件發(fā)生了改變或使用新批號的鱟試劑時，都可能會影響檢驗結果，此時需制作標準曲線來確認試驗的可靠性［5］。根據2010年版《中國藥典》二部附錄要求，制備細菌內毒素工作標準品稀釋液，例如2倍稀釋1.0、0.5、0.25、0.125和0.062 5 EU/ml，4倍稀釋2.00、0.50、0.125、0.031 25 EU/ml。將3個濃度的稀釋液，每一濃度的3支平行管的稀釋液各取適量分別加入到預先加有0.1 ml鱟試劑的實驗管中，混合均勻，插入細菌內毒素測定儀進行檢測，同時做2支陰性對照。當陰性對照在規(guī)定的時間內不發(fā)生反應，將全部數據用最小2乘法進行線性回歸分析。根據線性回歸分析，標準曲線的相關系數r≥0.980，證明試驗有效，否則須重新試驗。

3.4 干擾試驗鱟試驗法中為了確認供試品的pH值、溫度、濃度及蛋白質和一些非內毒素雜質等對內毒素的檢測不產生干擾，無論新藥老藥在建立內毒素檢查法時需先做干擾試驗，當供試品的來源、配方、生產工藝改變或使用新批號鱟試劑等任何可能會影響檢驗結果時，都需重做干擾試驗。

3.4.1 干擾預試驗將供試品用細菌內毒素檢查用水依次稀釋至2倍、4倍、8倍、16倍……，最后的稀釋倍數不得超過MVD，記為Ai液。一般不要以市售鱟試劑靈敏度計算所得的MVD作為起始濃度。注射液建議采用原液，粉針劑建議至少嘗試往上幾個濃度級，探索其干擾程度，如沒有干擾，方法則更可靠。以相同稀釋倍數的供試品溶液加入標準曲線中點(或附近點)濃度(設為λ1)的內毒素標準品，記為Bi液。分別取上述各液(每一濃度至少做3支平行管)適量加入預先加有0.1 ml TAL試劑的反應管內，混勻，立刻用細菌內毒素檢測儀進行檢測。實驗數據回歸處理，按所得線性回歸方程計算平均回收率。回收率(%)=(Bi液內毒素值－Ai液內毒素值)/λ1×100%。當內毒素的回收率在50%～200%之間，則認為在該試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。當內毒素的回收率不在指定的范圍時，可用加熱、過濾、中和、透析等方法去除干擾因素(注意不要使供試品內毒素失去活性)，重新進行干擾試驗。

3.4.2 正式干擾試驗一般選擇干擾預試驗中內毒素回收率接近100%的最大不干擾濃度或最小稀釋倍數，即可用這一最大不干擾濃度進行預干擾試驗的驗證。取不同廠家不同批號最少3批樣品制備下列供試液:①通過干擾預試驗的供試品溶液，不加內毒素，稀釋倍數不超過MVD;②加入標準曲線中點(或附近點)的一個已知內毒素濃度(設為λm)的供試品溶液，與①溶液稀釋倍數相同;③制備標準曲線的標準內毒素溶液，至少3個濃度(最低一點設為λ);④細菌內毒素檢查用水，不加內毒素，作為陰性對照。按干擾預試驗方法檢測，計算內毒素回收率，如果回收率在50%～200%之間，則確認在該試驗條件下可進行該供試品內毒素檢查。

3.5 供試品檢查供試品為不同廠家不同批號最少3批，按干擾試驗中的操作步驟進行檢測。用溶液②中的內毒素濃度減去溶液①中的內毒素濃度，計算出的內毒素的回收率，要在50%～200%的范圍內。溶液④(陰性對照)反應時間大于標準曲線最低濃度的反應時間。用溶液③生成的標準曲線來(溶液③的結果要符合r≥0.980的要求)計算溶液①的每一平行管的內毒素濃度，若供試品溶液平行試驗所得平均內毒素濃度乘以稀釋倍數后，小于規(guī)定的內毒素限值，則判定供試品符合規(guī)定;若大于或等于規(guī)定的內毒素限值，判定供試品不符合規(guī)定。

4 應用

《中國藥典》2010年版要求內毒素檢查的化學藥品424個，生物制品39個，多采用鱟試劑凝膠法或凝膠半定量法，采用動態(tài)濁度法定量測定的較少。近幾年儀器試劑的發(fā)展，技術的提高，有大量的文獻報道采用動態(tài)濁度法測定細菌內毒素含量。

4.1 化學藥化學藥類應用動態(tài)濁度法測定內毒素含量報道較多，涉及到普通注射劑、抗菌藥物、原料藥和放射性藥品等，如詹云麗等［6］研究利巴韋林輸液中細菌內毒素含量，采用動態(tài)濁度法，結果表明將混合液稀釋至5倍后進行細菌內毒素定量檢測是可行的。勞海燕等［7］對8種注射用頭孢菌素類抗生素定量稀釋，回收率為50%～200%，證實動態(tài)濁度法可以高效的測定頭孢類藥物的內毒素含量。顧炳仁等［8］將精氨酸原料藥配制成12.5 mg/ml的溶液時進行動態(tài)濁度定量測試效果滿意。王海云［9］對4種放射性藥品建立標準曲線，完成了動態(tài)濁度法測定內毒素含量。

4.2 中藥中藥注射劑成分復雜，干擾較多，苑慶華等［10］用細菌內毒素動態(tài)濁度法定量檢測柴胡注射液的細菌內毒素含量，稀釋到32倍時排除干擾，回收率在50%～200%范圍內，方法可行。黃桂勇等［11］使用細菌內毒素的動態(tài)濁度法可以高效地測定復方當歸注射液的細菌內毒素含量。舒玉萍等［12］在復方苦參注射液細菌內毒素定量檢查法的實驗探討中，供試液稀釋20倍無干擾，回收率50%～200%范圍內，可應用動態(tài)濁度法定量測定其細菌內毒素含量。

4.3 生物制品馬麗等［13］用動態(tài)濁度法對胸腺肽進行細菌內毒素含量測定，結果可行。羅宇芬等［14］對β－七葉皂苷鈉通過動態(tài)濁度法進行干擾試驗和驗證試驗，結果16倍稀釋無干擾。賓漫容等［15］對腦組織注射液應用動態(tài)濁度法檢測細菌內毒素，結果回收率在50%～200%，證明可用動態(tài)濁度法測定其內毒素含量。

內毒素動態(tài)濁度法由于標準曲線的建立，最大限度地消除了內毒素標準品對試驗結果的影響，試驗結果不受內毒素標準品準確性的影響，同時計算回收率更科學，對樣品干擾行為的描述更為準確，結果可以保存，利于質控，有可追溯性，尤其對于中藥注射劑，其定量意義更為重要。

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7勞海燕，林秋曉，馮聚錦.注射用頭孢菌素類抗生素細菌內毒素動態(tài)比濁定量法的研究［J］.中國藥科大學學報，2005，36(3):234－237

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10苑慶華，芮菁，華曉東.柴胡注射液中細菌內毒素定量檢查研究［J］.西北藥學雜志，2002，17(6):260－262

11黃桂勇.復方當歸注射液中細菌內毒素定量測定法［J］.山西中醫(yī)，2008，24(2):53－54

12舒玉萍，王美云.復方苦參注射液細菌內毒素定量檢查法的實驗探討［J］.齊魯藥事，2008，27(9):539－541

13馬麗，賓漫容，陳煥勇，等.胸腺肽注射液中的細菌內毒素的定量檢查［J］.中國生化雜志，2002，23(6):302－303

14羅宇芬，勞海燕，林秋曉，等.動態(tài)比濁法鱟試驗用于注射用β－七葉皂苷鈉細菌內毒素檢測［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2002，22(1): 7－8

15賓漫容，馬麗，陳煥勇，等.動態(tài)濁度法定量檢測腦組織注射液中的細菌內毒素［J］.中國現代應用藥學雜志，2002，19(6):493－494

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1006-5687(2014)01-0050-03

2013-12-03